Nat Biotechnol | 碱基编辑和先导编辑的遗传毒性

基因编辑是设计改造造血干细胞或祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells, HSPCs）的一种非常有前途的工具，为精确纠正致病突变开辟了可能性，同时还限制了全基因组插入突变以及转基因不受控的风险。在过去的十年中，CRISPR-Cas系统通过gRNA诱导位点特异性DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）已经得到广泛的应用【1】。DSBs可通过两种方式进行修复：（1）非同源或者微同源末端连接（non-homologous/microhomology-mediated end joining），常常在断裂位点产生插入或者缺失（insertion or deletion, indels）并导致编码序列的破坏或者调控作用；（2）定向同源重组（homology-directed recombination, HDR），利用具有同源序列的外源DNA产生基因替换或者插入。不过，DSBs会产生一些副作用，比如激活p53依赖的DNA损伤响应，导致大片段的缺失、易位或者染色体畸变等，这些都导致其遗传毒性风险增加【2,3】。另外，HDR介导的基因编辑仅可发生在细胞周期的S/G2期，这些都限制了其在HSPCs中进行基因编辑的应用。

最近，研究人员基于Cas切口酶（Cas nickase, nCas）开发了一些新的基因编辑技术，比如碱基编辑技术（base editing）和先导编辑技术（prime editing），这些新的编辑技术能够绕过DNA DSB和定向同源重组，仅实现小的编辑，但同时还能保证在编辑位点产生同源基因产物的效果。这些碱基编辑器（base editors, BEs）主要由一个作用于单链DNA的脱氨结构域（nucleotide deamination domain）以及一个能够产生单链断裂（single-strand break, SSB）的nCas组成，编辑器由一段给定的gRNA介导，并通过体内修复系统完成碱基编辑。

BEs主要分为两类：胞嘧啶碱基编辑器（cytidine BEs, CBEs），实现CG向TA转换；腺嘌呤碱基编辑器（adenine BEs, ABEs）实现AT向GC的转换【4】。在真核生物中，脱氨基的胞嘧啶（即尿嘧啶，uracil）会被尿嘧啶糖苷酶（uracil glycosylase, UG）快速识别并被碱基切除修复系统（base excision repair, BER）修复，而脱氨基的腺嘌呤（即肌苷，inosine）则不能被真核DNA修复系统识别。因此，CBEs编辑系统往往需要偶联一个UG抑制结构域以提高其编辑效率。

与碱基编辑不同，先导编辑能够产生所有类型的单核苷酸变体（single-nucleotide variants, SNVs）以及小的预期indels。PE2（prime editor 2）由一个nCas9融合一个逆转录酶结构域（reverse transcriptase, RT）组成。PE2在先导编辑gRNA（prime editor gRNA, pegRNA）引导下能够产生nCas9介导的DNA SSB，prgRNA同样为逆转录酶提供了配对模板。为了提高编辑效率，在PE2的基础上添加另外一条gRNA靶向结合非编辑链，能够促进异源双链的水解，这是新的PE3系统【5,6】。尽管上述系统具有非常多的优点，但目前对于他们在人体细胞中的短期毒性和长期毒性还了解的很少，这是这些具有潜力的新型编辑技术走向临床应用的必经挑战。

近日，来自意大利米兰IRCC San Raffaele Scientific Institute的Luigi Naldini和Samuele Ferrari团队在Nature Biotechnology杂志发表了他们最新的研究成果，题目是 Genotoxic effects of base and prime editing in human hematopoietic steme cells ，他们在人造血干细胞里横向对比了BEs、PEs和CRISPR/Cas9系统在编辑效率、细胞毒性、转录组变化以及基因组毒性等方面的差异，发现BEs和Pes会产生一些有害的转录反应，并降低了其编辑效率，同时也会产生一些基因删除或者易位，虽然比Cas9系统低，但仍不可忽视。

研究人员以β₂-microglobulin（β₂M）基因为研究对象，并首先对CBE（BE4 max）、ABE（ABE8.20-m）和Cas9系统进行了横向对比。为了达到B2M的敲除效果，Cas9诱导产生Indels，BE4产生提前的终止位点，而ABE8.20-m则是打断了剪接供体位点（splicing donor site）。在人体原代T细胞中，BE4 max和Cas9的敲除效率为80-90%，而ABE8.20-m的敲除效率达到95%以上。研究人员在CD34+的HSPCs中分别检测了三种编辑系统作用1天以及3天的编辑效果，发现总体上ABE8.20-m（88%）的敲除效率要高于BE4 max（63%）和Cas9（64%），同时处理一天的效率要低于三天。BE4 max和ABE8.20-m处理的HSPCs具有相似且比Cas9处理组高的克隆潜能，说明BEs处理组对HSPCs的影响比Cas9处理组小。

研究人员发现，几乎所有的ABE8.20-m编辑等位基因都出现碱基颠换现象，BE4 max编辑的等位基因有1/3在靶点处出现Indels，而Cas9编辑的细胞则在DSB处出现Indels。BE4 max处理的等位基因出现Indels的比率在作用一天时比作用三天时高，同时，一些BER相关基因（例如APEX1和UNG等）的表达也是作用一天比作用三天高，说明BE4 max产生的indels可能是UG抑制效果低引起的。

接下来，研究人员分别对三种系统在细胞中产生大段基因缺失、易位以及激活p53响应的作用进行了对比，结果显示在克隆细胞中，Cas9产生了约12%的单基因或者双等位基因的缺失，BE4 max产生了约5%的缺失，而ABE8.20-m则很少产生基因缺失。Cas9和BE4 max系统编辑发生了明显的基因易位现象，而ABE8.20-m仍旧很少产生基因易位现象。与之类似，Cas9和BE4 max同样引起了p53响应，不过BE4引起的相应比Cas9低。不同的是，BE4和ABE8.20-m都引起了IFNα和IFNγ响应，而Cas9则没有。

之后，研究人员在免疫缺陷小鼠中进行了异种移植实验，分别选取三种编辑方式处理一天以及三天的细胞进行移植，9-12周后检测不同免疫组织中移植物的大小。结果显示，在整个实验过程中，Cas9处理的移植物一直比对照组小，这可能是由于较高的p53响应引起的细胞凋亡导致的，而碱基编辑处理的移植物只有在最后一周才比对照组低。而对移植物的编辑效率，在整个实验过程中ABE8.20-m一直维持在很高的水平，Cas9处理组则一直维持在较低的水平。不同的是，BE4 max在体内的编辑效率则和其在体外相反，处于一个很低的水平，且随着时间推移还在继续降低，说明其在长期处理HSPCs时具有较大的副作用和较低的编辑效率。深度测序也反应ABE8.20-m在HSPCs中实现了最大程度的碱基颠换，而BE4 max则仅诱导了很少的碱基颠换，这与细胞中较高的BER基因表达水平有关。

研究人员对BE4 max系统进行了改进，他们在mRNA上添加了一个5’ cap，以更好的结合内源结构，同时还在其5’ UTR区域添加了一个eIF4G适配体（aptamer），这些优化措施能够降低mRNA的剂量并提高其编辑效率，并抑制IFN和p53响应。利用优化的mRNA和p53显性负突变（dominant-negative mutant）GSE56共转染能够显著降低p21的诱导表达，虽然代价是微弱降低了BE4 max的编辑效率和促进了靶点附近indels的诱导数量。不过，与未优化的mRNA相比，优化后的BE4 max系统产生的indels已经得到明显降低。优化的mRNA能够使ABE8.20-m在小鼠异种移植实验中达到超过90%的编辑效率，BE4 max也能达到接近80%的编辑效率。

最后，研究人员也对PE3系统进行了检测，结果显示，PE3系统处理后的细胞同样发生IFN、p53响应，还产生了未折叠蛋白相应。同时，PE3的编辑效率要比Cas9低，不过Cas9对HSPCs产生的影响要比PE3大。而且，PE3还能特异性激活TP73，在长期的异种移植体内实验中，PE3能够长期保持约60%的编辑效率。

总之，本研究横向对比了BEs、PEs和Cas9分别在体外和体内对HSPCs进行编辑的效率和副作用，几种方法中CBEs因为体内存在的UG系统而使其编辑效率减弱，副作用增强，通过mRNA优化以及同时表达UG抑制因子能够提高其编辑效率和应用范围。ABE具有最优的体外体内编辑效率和最低的副作用，且因为体内不存在其拮抗系统，使得其应用简单，联合优化的mRNA使其在体内编辑效率能够达到90%以上。Pes也具有一定的体内编辑效率，但其仍能产生indels，这限制了其进一步的发展。

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