饶毅实验室新进展：ppGpp调控睡眠

四磷酸鸟苷（ppGpp）也被称为也被称为魔点核苷 (“magic spot” nucleotide)。长期被认为只存在于原核生物（细菌），其功能为参与细菌对饥饿的应激反应。

近日，饶毅实验室发表其研究睡眠分子机理的第8篇论文。

该实验室研究生戴熙慧敏和杨威等的研究结果揭示：ppGpp不仅存在于果蝇中，由果蝇内生的表达，并且参与抑制果蝇睡眠，特别是果蝇饥饿情况下的睡眠。他们还发现ppGpp很可能在果蝇类胰岛素能神经细胞中起调节睡眠的作用。

ppGpp最初被发现在细菌氨基酸饥饿中发挥关键功能。之后在植物中也发现了它的存在。而ppGpp在动物中是否也存在？如果存在，它的作用是什么？除了内稳态和节律之外，睡眠也会受到环境因素，比如饥饿的调控。但是这背后的分子机制和神经环路都并不清楚。

饶毅实验室的研究生戴熙慧敏、杨威、周恩兴等合作筛选影响果蝇睡眠的基因。这次发表的研究证明ppGpp同样会表达在果蝇中，并且它发挥了睡眠调节特别是饥饿下的睡眠调节的功能。

在本研究的初期，利用黑腹果蝇强大的遗传操作能力，戴熙慧敏、杨威等在对近两千株黑腹果蝇突变体进行了睡眠筛选。

这一筛选此前已经发表两篇论文，分别研究D-serine和ACh调控睡眠。

筛选中发现了一种睡眠模式异常，特别是睡眠潜伏期异常的突变体。

睡眠潜伏期是指动物入睡所需的时间，而这一突变体入睡时间显著变长，并且夜间睡眠时长缩短。

进一步的研究发现，这一异常与一个被称为Mesh1的基因突变有关。蛋白质序列分析表明，Mesh1基因可能参与ppGpp的代谢，将ppGpp转化为GDP。

然而ppGpp此前并不被认为在动物中存在或者发挥功能，其长期被认为是细菌氨基酸饥饿响应的关键调节因子，这一筛选结果促使研究人员对ppGpp在果蝇中可能的分布和在睡眠中的潜在调节作用进行了深入的研究。

戴熙慧敏、杨威等首先进行了Mesh1基因完全敲除果蝇的构建和回复表达分析，并且确认了筛选到的睡眠表型的确是由Mesh1基因介导的。在随后对ppGpp进行定量分析时，研究人员遇到了一个新的挑战：由于ppGpp的浓度太低，对其的检测十分困难。为解决这一问题，杨威寻求北京大学化学院张新祥实验室的Xiaohui Zhang合作开发了一种浓缩定量的分析过程，以浓缩并分析来自数千只果蝇的ppGpp，并最终成功地从2,000只果蝇的脑提取物中富集并定量测定了ppGpp的浓度。这确证了ppGpp在果蝇中的存在。进一步的分析发现在无菌果蝇中，其浓度也相对稳定，这表明其主要来源是果蝇自身而不是其食物。此外在Mesh1基因敲除的果蝇中，ppGpp浓度显著增加，这验证了Mesh1基因参与调解ppGpp的水解。更重要的是，在饥饿果蝇中，ppGpp浓度明显上升，这暗示ppGpp可能在果蝇中发挥了类似其在细菌中的饥饿信号介导的功能。研究人员进一步通过回复表达Mesh1，分析Mesh1基因在果蝇神经系统中的表达图谱，异位表达大肠杆菌的ppGpp合成酶RelA，过表达Mesh1，等实验进一步证明ppGpp参与睡眠的调控。

对Mesh1基因在果蝇神经系统中的表达分析发现，Mesh1在黑腹果蝇的大脑中的后中间脑区（PI）有表达。PI里有一类分泌胰岛素的细胞（Insulin producing cells, IPC），通过选择性调控ppGpp合成以及水解的表达区域，研究人员发现，IPC细胞中的类胰岛素-2 （Dilp2, Drosophila insulin-like peptide ）表达细胞中的ppGpp在睡眠调控中起到了关键的作用。

睡眠受到内在睡眠需求与外部环境的综合驱动，而饥饿便是外部环境的重要元素之一。同时作为动物的基本需求，动物在饥饿和困倦之间会如何选择？以往的研究已经表明，饥饿会导致果蝇睡眠减少，这被称为“饥饿诱导睡眠丧失(SISL)”。这一现象可能有利于促进动物在饥饿状态下的觅食行为。ppGpp在细菌中参与调控氨基酸饥饿下的应激行为，Dilp2表达细胞中的ppGpp在睡眠调控中起到关键作用，而以往的研究表明，Dilp2表达细胞参与调控SISL。这些线索让研究人员进一步开展了对ppGpp在SISL中的作用的研究。他们发现，Mesh1突变或ppGpp合成酶的过表达会加剧SISL，而Mesh1的过度表达则会抑制SISL。并且，Dilp2表达细胞中的ppGpp也对SISL的调控至关重要。

综上，这项研究提供了ppGpp在果蝇中的存在的有力证据，而且发现ppGpp在抑制睡眠和调节由饥饿引起的睡眠丧失方面发挥着重要作用，揭示了PI脑区，特别是类胰岛素能细胞在ppGpp调控中的关键作用。这一发现对于理解睡眠调节和饥饿响应的分子机制具有重要意义，为未来相关领域的研究提供了新的方向。

2023年10月16日，他们的研究结果发表期刊hLife上，题为ppGpp is Present in, and Functions to Regulate Sleep of, Drosophila（ppGpp存在与果蝇中并调节其睡眠）。

戴熙慧敏与杨威为共同第一作者。戴熙慧敏现在美国Brandeis大学诺贝尔奖得主Michael Rosbash实验室做博士后，杨威在北京的微软分部工作。该文主要结果于2022年在bioRxiv线上公布(bioRxiv 2022.11.17.516975)。

饶毅实验室第一篇睡眠分子机理的研究论文发表于2017年，其第一作者钱永军毕业后到美国做博士后，在Duke大学期间发表基因操纵的论文（Nature 610:713-721, 2022)后，得到国内外多个职位（在北大的全部申请过程饶毅全部不参与、今后研究完全独立于饶毅），最后加入北大未来技术学院任助理教授、主持独立实验室（PI）。

2017年至2023年饶毅实验室发表的八篇睡眠机理论文中，6篇涉及果蝇、3篇涉及小鼠（其中一篇同时研究了果蝇和小鼠）。‍