想要中标国自然，研究方案的独特性与前沿性尤为重要！

在国自然申请书研究方案的撰写中，被专家批的最多的主要有以下三个问题：① 研究技术使用过于单调；② 方案设计全面性不够；③ 方案更像技术堆叠，缺乏内在逻辑。在之前的推文中我们给大家详细举例了研究方案逻辑清晰、验证全面的方案应该怎么来设计，那么今天我们就着重来解决研究技术使用过于单调这一问题。  

首先，我们传统分子实验设计一般来说检测手段是四大件：qRT-PCR、western blot、IHC、ISH。这些实验必然在标书的设计中占得比重会很大，作为基础检测这些方法是避不开的，千万不要为了追求高大上舍弃这些实验，这是不可能完成的。但是这其中IHC和ISH两个组织学鉴定可以做的高级和复杂一点，比如多色荧光染色技术（TSA）的使用。这种技术在基因/蛋白的组织、细胞水平共定位方面发挥非常重要的作用，而且也是现在热门的单细胞测序技术必备验证实验。比如你想做某个蛋白在X细胞中的表达定位，那么在组织切片上共孵育X细胞的marker和这个蛋白的抗体然后再用不同荧光的二抗结合就可以了。其实就是IHC的升级版，目前最多的加上DAPI可以有七种颜色。

多色免疫荧光划分肿瘤微环境区域

然后在此基础之上再辅以一些高大上的技术，用基础技术证明趋势与上下游逻辑，再以关键技术完善证据链，这也成了目前国自然中标标书的普遍选择；那么有哪些技术呢，我们可以看看下图：

这是2025国家医学重点发展技术方向，这里面就包括了我们可以应用于国自然研究申请的很多前沿技术。将这些技术合理的、有机的结合进我们的研究方案中会显著提升研究方案的前沿性和独特性。

首当其冲的应该是分子结合实验，即技术上都是基于免疫沉淀技术发展出来的各种pull down技术，而我们实际运用中在分子层面经常会人为干预使他们不结合；这样可以反向确定二者的结合关系以及结合了有什么用处；这里面最推荐的就是基因定点突变技术了。这个技术大家可能比较陌生，但是顶级文章里面我们经常看见的XX基因mut组其实就是这个技术处理出来的产物。它可以特异性突变两个蛋白、RNA和蛋白等等的结合位点，也可以突变一些修饰位点比如组蛋白乙酰化位点、蛋白泛素化位点等等。

还可以用来构建一些酶的失活突变体，就是把酶的活性位点突变掉让其失活。这些位点的突变分别可以说明不同的问题，比如修饰位点突变，可以使得修饰酶结合不上去进而不发生某种修饰，我们就可以进行下游检测确定这种修饰对于细胞的影响了。

再来就是条件性敲除鼠的应用；这种转基因技术的使用终结了我们个体层次很难做分子干预的历史。它与传统的全基因敲除模型相比可以精准到个体中某个细胞水平特异性敲除基因，这样就不怕专家说周身基因敲除会导致个体发生其他问题了。当然，好的技术就有限制条件咯，要求靶细胞有明确的marker蛋白，所以肿瘤细胞不可以做条件性敲除；但是肿瘤细胞可以体外做了干预再建模，所以本身也没有问题。条件性敲除技术主要针对的是非肿瘤疾病、肿瘤微环境等研究方向，特别是一些干细胞和干细胞样的细胞，还有免疫细胞等。

然后最后推荐的就是类器官（organoids）。顾名思义，类似器官的模型，是一类由干细胞，包括多能干细胞（pluipotent stem cell, PSC）和成体干细胞（adult stem cell, ASC），在体外培养时形成的能够进行自我组装的微观三维结构。因其与对应的器官拥有类似的空间组织、保持一些关键特性并能够重现部分生理功能，而被认为是检测人类生物学和疾病方面的新模型。相较于细胞系（cell lines）、基因工程鼠（genetically engineered mouse models, GEMMs）和人源化异种移植鼠（patient-derived xenografts, PDX）这些传统的研究模型，类器官模型（鼠源类器官mouse-derived organoids, MDO和人源类器官patient-derived organoids, PDO）不但能够取自正常组织和组织癌变过程中各个阶段的肿瘤组织，而且其培养体系简单易操作，时间和金钱成本较低，且具有较高效率，因而得到广大研究人员的亲赖，被Nature Methods评为2017年生命科学领域年度技术。类器官作为一个新兴的技术，在科学研究领域潜力巨大，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验。也可以为国自然方案设计增加一个体外干预层次，减少动物实验经费支出。

    好了，那研究方案我们就讲完了，下期我们重点突破“研究内容”的写法，下期见。