再问基因克隆纯化蛋白后蛋白质分子量不对的问题。# Biology - 生物学
c*u
1 楼
正常的话15个工作日应该是三周，但是如果赶上中国的法定假日，比如十一和中秋的话
，是不是check的时间会相应加长了？
，是不是check的时间会相应加长了？
j*a
2 楼
谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解，有什么
方法补救吗？
背景：拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。
（我的insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.
方法补救吗？
背景：拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。
（我的insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.
c*u
3 楼
顶！
【在 c*******u 的大作中提到】
: 正常的话15个工作日应该是三周，但是如果赶上中国的法定假日，比如十一和中秋的话
: ，是不是check的时间会相应加长了？
【在 c*******u 的大作中提到】
: 正常的话15个工作日应该是三周，但是如果赶上中国的法定假日，比如十一和中秋的话
: ，是不是check的时间会相应加长了？
g*y
4 楼
不要只看你的insert 的基因序列，仔细看看你insert的基因前面有没有ATG. 如果有，
可能翻译起始位点都不一样。 我有一次从别人那里拿了一个vector. 把我的基因插到
mcs里，后来发现表达不对，再来查原基因，原来mcs之前还有一个signal peptide. 而
且不在一个frame里，于是又作克隆去除那个signal peptide才搞对。
可能翻译起始位点都不一样。 我有一次从别人那里拿了一个vector. 把我的基因插到
mcs里，后来发现表达不对，再来查原基因，原来mcs之前还有一个signal peptide. 而
且不在一个frame里，于是又作克隆去除那个signal peptide才搞对。
U*u
5 楼
他们好像什么假都过吧？
我们公司曾经找本州的议员发信给领事馆询问这种被check的事，虽然领事馆回信说这
是正常手续，check不是在领事馆/大使馆，而在美国本土进行，但是很快就会有结果。
他们说的15个工作日大概只是平均，运气好很快的。
祝你好运。
我们公司曾经找本州的议员发信给领事馆询问这种被check的事，虽然领事馆回信说这
是正常手续，check不是在领事馆/大使馆，而在美国本土进行，但是很快就会有结果。
他们说的15个工作日大概只是平均，运气好很快的。
祝你好运。
g*y
6 楼
还有你induce你的细胞之后，有没有直接看细胞 表达蛋白的mw? 如果是35kd,纯化后变
成20kd那就是纯化过程中的问题
了。
His
【在 j*****a 的大作中提到】
: 谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解，有什么
: 方法补救吗？
: 背景：拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。
: （我的insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
: 柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.
成20kd那就是纯化过程中的问题
了。
His
【在 j*****a 的大作中提到】
: 谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解，有什么
: 方法补救吗？
: 背景：拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。
: （我的insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
: 柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.
c*u
7 楼
谢谢！
【在 U***u 的大作中提到】
: 他们好像什么假都过吧？
: 我们公司曾经找本州的议员发信给领事馆询问这种被check的事，虽然领事馆回信说这
: 是正常手续，check不是在领事馆/大使馆，而在美国本土进行，但是很快就会有结果。
: 他们说的15个工作日大概只是平均，运气好很快的。
: 祝你好运。
【在 U***u 的大作中提到】
: 他们好像什么假都过吧？
: 我们公司曾经找本州的议员发信给领事馆询问这种被check的事，虽然领事馆回信说这
: 是正常手续，check不是在领事馆/大使馆，而在美国本土进行，但是很快就会有结果。
: 他们说的15个工作日大概只是平均，运气好很快的。
: 祝你好运。
s*n
8 楼
我觉得如果你的蛋白能够用Ni-NTA column纯化说明N端的His-tag没问题，很大可能是
翻译提前终止或者降解了。如果是翻译提前终止的话，可能是稀有密码子的缘故，你可
以试试一些带有稀有tRNA的菌株，如Rossetta系列，也可以直接合成codon optimized
的基因。如果是降解的话需要分析一下是in vivo还是in vitro，in vivo很麻烦，可能
要换菌株，in vitro的话可以在做cell lysis的时候加protease inhibitors.
翻译提前终止或者降解了。如果是翻译提前终止的话，可能是稀有密码子的缘故，你可
以试试一些带有稀有tRNA的菌株，如Rossetta系列，也可以直接合成codon optimized
的基因。如果是降解的话需要分析一下是in vivo还是in vitro，in vivo很麻烦，可能
要换菌株，in vitro的话可以在做cell lysis的时候加protease inhibitors.
j*3
9 楼
是的，我去年被check时就遇上中秋节，前后一共20天，不光是工作日，全加在一起是
这么多天。
这么多天。
k*u
10 楼
你要表达的是啥蛋白？
His
【在 j*****a 的大作中提到】
: 谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解，有什么
: 方法补救吗？
: 背景：拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。
: （我的insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
: 柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.
His
【在 j*****a 的大作中提到】
: 谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解，有什么
: 方法补救吗？
: 背景：拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。
: （我的insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
: 柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.
j*a
11 楼
fructose bisphosphate aldolase
k*u
12 楼
看了下，这个蛋白做的挺多的，而且也不是膜蛋白。。。
前面有个人都提到了，我觉得首先你要考虑目标基因的来源，如果和
表达的系统差距比较大的话，先考虑codon variation的可能性。
其次，如果C端有其它tag的话，可以直接破细胞检测下，看是不是表达中止。
如果是降解的问题，试试看蛋白酶抑制剂，对于大肠杆菌，还可以试试看低温
诱导，或者不用IPTG，还有其它诱导方式的。
【在 j*****a 的大作中提到】
: fructose bisphosphate aldolase
前面有个人都提到了，我觉得首先你要考虑目标基因的来源，如果和
表达的系统差距比较大的话，先考虑codon variation的可能性。
其次，如果C端有其它tag的话，可以直接破细胞检测下，看是不是表达中止。
如果是降解的问题，试试看蛋白酶抑制剂，对于大肠杆菌，还可以试试看低温
诱导，或者不用IPTG，还有其它诱导方式的。
【在 j*****a 的大作中提到】
: fructose bisphosphate aldolase
j*a
13 楼
Thank you very much.
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