怎么保持蛋白结构？ - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

怎么保持蛋白结构？

怎么保持蛋白结构？# Biology - 生物学

n*r2010-12-15 08:12

1 楼

妈妈到美国来看我，准备呆半年时间至明年二月底。可是妈妈来不久后我就发现怀孕了
,预产期是明年五月。如果要妈妈来帮我做月子，妈妈就只能在国内呆两个月就要回美
。我现在很担心妈妈再次入境时只给很短的时间。身边也听说有一些例子。我想问，妈
妈这种情况入关时只给很短的时间的几率有多大？是很普遍还是很少见？如果我给她改
机票让她这个月底就回去，这样在国内呆4个月再回来是不是会好很多，还是反正也不
到六个月，和不改期也没多大区别？
这里热心人多，谢谢大家的回复！

n*r2010-12-15 08:12

2 楼

【以下文字转载自 JobHunting 讨论区】
发信人: nickbear (Keep your feet on the ground.), 信区: JobHunting
标题: 求建议Onsite Presentation Topic选择
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jun 5 15:13:14 2013, 美东)
最近拿到一个onsite，需要做45分钟的presentation
最大的问题是听众的背景很分散，机械材料软件硬件数学的都有
我以前做presentation的都是听众背景专一的场合，比如开会，公司讨论
HM建议是参考Ted talk那种新技术科普性质的，我觉得很难做到
讲软件项目，觉得没有什么高深技术含量可以吹
讲PHD的Research，估计现场没有人懂

E*T2010-12-15 08:12

3 楼

太阳没有与任何行星构成任何相位－－这个怎么解释？
是不是就是测出来那个盘（图片）上，太阳（日）没有和其他星星有任何连线？？

b*k2010-12-15 08:12

4 楼

【以下文字转载自 Literature 讨论区】
发信人: bigchipmunk (花姥姥), 信区: Literature
标题: [清凉消夏晚会]──英格兰乡间：）
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Aug 14 13:46:08 2011, 美东)
给已经习惯在北美澳洲国内大城市生活的同学们吹点儿我们乡村的小风儿：P
听说北美的农村风格也很不相同，我很喜欢这种很田园的风格，最后一张是当地小店橱
窗：）

b*32010-12-15 08:12

5 楼

核磁出来没多少峰，导师认为蛋白没有折叠，大肠表达，纯化什么的都没问题，怎么办
？谢谢！

s*x2010-12-15 08:12

6 楼

最近这样的例子越来越多了
只给两个月甚至两个星期的都有
关键是这次你呆多久，回去多久
如果你这次只呆一两个月，下次得到六个月的机会大些
我知道的一些父母，每次只来一两个月，在cbp那里却每次都得到六个月的stay，哪怕
刚刚回去一个月再来仍然给六个月，因为他们的入境记录让cbp相信他们不是来美国长
久居住的。相反，有些父母第一次就来满六个月，哪怕回去呆了五个多月，再来的时候
还是会被刁难，因为呆过一次满六个月的，基本上cbp就知道他们将来会怎么做了

M*k2010-12-15 08:12

7 楼

看职位要求没？往职位要求上靠啊，和你联系的人，你也可以问问他们想听神马内容，
不要闭门造车。

E*T2010-12-15 08:12

8 楼

当太阳没有与任何行星构成任何相位，这意味着缺乏对异性的吸引力，从而妨碍了盘主
步入婚姻关系的进程。
－－－－－我是太阳空相……NNDX！！！没有异性缘原来真的不是我的错……是俺滴命
啊～～～～我要美女！！！

m*y2010-12-15 08:12

9 楼

给人一种心旷神怡的感觉
很向往这样的悠闲

【在 b*********k 的大作中提到】

: 【以下文字转载自 Literature 讨论区】
: 发信人: bigchipmunk (花姥姥), 信区: Literature
: 标题: [清凉消夏晚会]──英格兰乡间：）
: 发信站: BBS 未名空间站 (Sun Aug 14 13:46:08 2011, 美东)
: 给已经习惯在北美澳洲国内大城市生活的同学们吹点儿我们乡村的小风儿：P
: 听说北美的农村风格也很不相同，我很喜欢这种很田园的风格，最后一张是当地小店橱
: 窗：）

m*z2010-12-15 08:12

10 楼

NMR没有多少峰的原因很多吧，比如蛋白太大或者多聚,multiple conformational
state等等。。反正我之前作的一个蛋白，肯定fold是没有问题的（nice alpha-
helical structure by CD and even crystal structure)，NMR出来就是没有几个峰。
我觉得不能用这个来推断没有folding.
相反，没有folding的蛋白据我理解应该有很多峰，只不过这些峰不disperse,全部集中
在HSQC中间的地方，这个好像是没有folding的一个特征。
CD应该是相对容易得看蛋白有没有folding得不错的方法

【在 b******3 的大作中提到】

: 核磁出来没多少峰，导师认为蛋白没有折叠，大肠表达，纯化什么的都没问题，怎么办
: ？谢谢！

n*r2010-12-15 08:12

11 楼

我妈妈已经来美多次，从来没有延期过，但每次都呆5个多月近六个月。然后回国呆半
年至一年或更久再入境。以前都是给的6个月。但这次因为情况特殊只能在国内呆两个
月，所以很担心。谢谢分享经验！

【在 s******x 的大作中提到】

: 最近这样的例子越来越多了
: 只给两个月甚至两个星期的都有
: 关键是这次你呆多久，回去多久
: 如果你这次只呆一两个月，下次得到六个月的机会大些
: 我知道的一些父母，每次只来一两个月，在cbp那里却每次都得到六个月的stay，哪怕
: 刚刚回去一个月再来仍然给六个月，因为他们的入境记录让cbp相信他们不是来美国长
: 久居住的。相反，有些父母第一次就来满六个月，哪怕回去呆了五个多月，再来的时候
: 还是会被刁难，因为呆过一次满六个月的，基本上cbp就知道他们将来会怎么做了

b*d2010-12-15 08:12

12 楼

mark

【在 M*****k 的大作中提到】

: 看职位要求没？往职位要求上靠啊，和你联系的人，你也可以问问他们想听神马内容，
: 不要闭门造车。

s*i2010-12-15 08:12

13 楼

我正巧琢磨过女的日空相和男的月空相。我LD是月空相，困难户，哈哈
马上翻出来给你看

L*t2010-12-15 08:12

14 楼

上次从London坐火车北上，一路上就是看到这些绿油油的地方啊，当然也有点地方干不
拉的。
下车一看，那地方也真像个小城镇，以前还看足球的时候，听过这个现在已经没落的足
球队的地方。呵呵。街道都是好陈旧但是到处都是历史的气息。估计随便哪个角落都会
有段历史？

【在 b*********k 的大作中提到】

C*m2010-12-15 08:12

15 楼

15N HSQC 没有多少峰？那一维氢谱的methyl区呢？

【在 b******3 的大作中提到】

: 核磁出来没多少峰，导师认为蛋白没有折叠，大肠表达，纯化什么的都没问题，怎么办
: ？谢谢！

n*22010-12-15 08:12

16 楼

我妈在我怀孕三个月的时候来呆了三个月，回去两个月后入境，被问为什么又来了，老
妈老实回答女儿生孩子，入境官问，你想呆多久，老妈说想呆6个月帮帮我，机票定的
时六个月的，汗，我是卡这天定的，在底特律入境的，没有中文翻译，一个学生帮翻译
的，给了我妈整六个月。老妈是个虔诚的基督徒，说上帝保佑她，从签证到入境都很顺
利。老爸不信，被拒了两次，再汗！

s*i2010-12-15 08:12

17 楼

请关注第一篇最后一段，你是“众人仰慕与追随的榜样”！
有没有异性缘也不是光看日空相/月空相的。何况桃花多没用，抓住一朵好的就成。
我不是随口说说安慰你，是星盘预示的，象我们酱紫中天在天蝎的，在异性眼中是值得
嫁/娶的人，哈哈
=========================================================
zz太阳的空相位
你拥有一种绝对阳光的性情，举手投足皆尊贵无比、倍受瞩目。
你永远用积极的眼光看待自己和别人。你善于直接用眼神去交流。你的眼光是那样的充
满了魔力，以至于一个眼神就可以让他人放下武装，放松下来。
虽然在内心中你是主张民主和人人平等的，但是你那与生俱来的傲骨、贵族气质和帝王
般的自信，让你似乎具有一种神授的权利。而且你的傲骨不是后天产生的，而是你的内
心就给你这种确认：你是独一无二的。
你不是刻意的远离他人，而是一种天生的态度使你疏远他人，而只沿着自己的独特人生
轨道前进。
但你也可以很轻松的和别人很快建立良好关系。虽然你不会受到任何人的任何评价的控
制并进行任何改变，也不会刻意去需求别人的确认。你不是谦逊的，你的内心最深处，
有一种和整个星际的联系，那是一种和平安静的宏大力量，使你不必去尝试别人的做法
，假装一种服从。甚至于，对于你在别人心目中的角色，你根本都不会去关心。因为你
知道，无论你如何去做，你都会成为众人仰慕与追随的榜样。
============================================================
zz太阳空相的女性和月亮空相的男性
太阳空相的女性，首先性格上、择偶标准和观念上就有些特殊。其次在比较盘中，除非
能和她的太阳成和谐相位，否则实在是很难疏导她太阳的能量，然而太阳却是力量强大
的，其他个人行星与其成相位差不多都是被吸引，这对于日空的一方来说，还是不能被
满足。这里我觉得，日日和谐相位是最有利的，其次日和谐土冥，再次还有一种就是日
空和谐对方的月亮，对方的太阳和谐日空的月亮。其他诸如日火日金等等，我觉得都不
能从根本上解决问题。因此，造成了日空的女性择偶上的难度。导致了找到Mr. Right
的困难。
而男性月空道理与女日空相似，但是比日空容易一些。同样，这里男性月空并不是说对
女性没有吸引力，而是他们能真正投入去喜欢、去接受的女人不好找。他们也很难打开
心门。但是月亮没有太阳那么多事，月亮为反光体，接受能量变得容易一些。月亮也比
太阳更容易满足。比较盘中几乎任何与月亮和谐的行星都能够疏导缓和月亮，以日金火
为首。因此虽然月空的男人在婚配择偶上较一般人困难一些，却比日空的女性容易。

b*k2010-12-15 08:12

18 楼

恩，英国这种地方挺多的

【在 L******t 的大作中提到】

: 上次从London坐火车北上，一路上就是看到这些绿油油的地方啊，当然也有点地方干不
: 拉的。
: 下车一看，那地方也真像个小城镇，以前还看足球的时候，听过这个现在已经没落的足
: 球队的地方。呵呵。街道都是好陈旧但是到处都是历史的气息。估计随便哪个角落都会
: 有段历史？

J*n2010-12-15 08:12

19 楼

没错，看看1D的，就知道折叠没有了。
我们这里，小蛋白做结构前，通常都会扫一下1D，看看methy和aromatic区间有没有明
显的shift。
没有的话，有可能就是没折叠好，还有可能蛋白本身就是属于intrinsically
disordered。需要找到binding partner才能有稳定的结构。

【在 C*********m 的大作中提到】

:
: 15N HSQC 没有多少峰？那一维氢谱的methyl区呢？

q*g2010-12-15 08:12

20 楼

多数情况最有力的就是诚实。
愿你老爸早日来美。

【在 n*********2 的大作中提到】

: 我妈在我怀孕三个月的时候来呆了三个月，回去两个月后入境，被问为什么又来了，老
: 妈老实回答女儿生孩子，入境官问，你想呆多久，老妈说想呆6个月帮帮我，机票定的
: 时六个月的，汗，我是卡这天定的，在底特律入境的，没有中文翻译，一个学生帮翻译
: 的，给了我妈整六个月。老妈是个虔诚的基督徒，说上帝保佑她，从签证到入境都很顺
: 利。老爸不信，被拒了两次，再汗！

E*T2010-12-15 08:12

21 楼

。。。我真的没有异性缘。。。。
我也不傲骨啊。。只是我确实有点儿懒得答理别人。。。
觉得跟我没啥关系。。随便吧。。。。
我要积极。。积极。。积极。。我要人生态度积极积极积极。。
好多人跟我一开始接触，都觉得我，就是那种，冷漠，冷峻，傲布拉吉，不爱理人，不好接触的感觉。。可是。。可是。。。俺也有一颗侠骨柔肠的心啊～～～

【在 s*******i 的大作中提到】

: 请关注第一篇最后一段，你是“众人仰慕与追随的榜样”！
: 有没有异性缘也不是光看日空相/月空相的。何况桃花多没用，抓住一朵好的就成。
: 我不是随口说说安慰你，是星盘预示的，象我们酱紫中天在天蝎的，在异性眼中是值得
: 嫁/娶的人，哈哈
: =========================================================
: zz太阳的空相位
: 你拥有一种绝对阳光的性情，举手投足皆尊贵无比、倍受瞩目。
: 你永远用积极的眼光看待自己和别人。你善于直接用眼神去交流。你的眼光是那样的充
: 满了魔力，以至于一个眼神就可以让他人放下武装，放松下来。
: 虽然在内心中你是主张民主和人人平等的，但是你那与生俱来的傲骨、贵族气质和帝王

J*a2010-12-15 08:12

22 楼

你说的难道是leeds U？

【在 L******t 的大作中提到】

b*32010-12-15 08:12

23 楼

楼上几位都太给力了，能不能给一些文献参考一下！这个19K的蛋白，还只是一个
domain，还是预测的序列，如果还是多聚，我就不用毕业了。

【在 m**z 的大作中提到】

: NMR没有多少峰的原因很多吧，比如蛋白太大或者多聚,multiple conformational
: state等等。。反正我之前作的一个蛋白，肯定fold是没有问题的（nice alpha-
: helical structure by CD and even crystal structure)，NMR出来就是没有几个峰。
: 我觉得不能用这个来推断没有folding.
: 相反，没有folding的蛋白据我理解应该有很多峰，只不过这些峰不disperse,全部集中
: 在HSQC中间的地方，这个好像是没有folding的一个特征。
: CD应该是相对容易得看蛋白有没有folding得不错的方法

h*n2010-12-15 08:12

24 楼

这个问题问了也是没有答案，就看运气了。

b*k2010-12-15 08:12

25 楼

你就是外冷内热，我早看出来了

不好接触的感觉。。可是。。可是。。。俺也有一颗侠骨柔肠的心啊～～～

【在 E**********T 的大作中提到】

: 。。。我真的没有异性缘。。。。
: 我也不傲骨啊。。只是我确实有点儿懒得答理别人。。。
: 觉得跟我没啥关系。。随便吧。。。。
: 我要积极。。积极。。积极。。我要人生态度积极积极积极。。
: 好多人跟我一开始接触，都觉得我，就是那种，冷漠，冷峻，傲布拉吉，不爱理人，不好接触的感觉。。可是。。可是。。。俺也有一颗侠骨柔肠的心啊～～～

L*t2010-12-15 08:12

26 楼

是不是越往北越这样？
比方说 Scotland

【在 b*********k 的大作中提到】

: 恩，英国这种地方挺多的

p*s2010-12-15 08:12

27 楼

测测correlation time，也许知道是不是多聚了。我觉得是多聚的可能性比较大，就算
是没折叠的，也不会峰很少
要不做做H-C HMQC，不过估计比较贵，哈哈

【在 b******3 的大作中提到】

: 楼上几位都太给力了，能不能给一些文献参考一下！这个19K的蛋白，还只是一个
: domain，还是预测的序列，如果还是多聚，我就不用毕业了。

s*x2010-12-15 08:12

28 楼

话是这么说
但是不少时候也不能不打自招地直说
比如很多福建的签b2的时候不能说自己是偷渡的
很多来帮忙带孩子的签证的时候不能这么说一样
应该这么说，诚实也是一门艺术

【在 q********g 的大作中提到】

: 多数情况最有力的就是诚实。
: 愿你老爸早日来美。

E*T2010-12-15 08:12

29 楼

你突然出现。。吓人啊？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？

【在 b*********k 的大作中提到】

: 你就是外冷内热，我早看出来了
:
: 不好接触的感觉。。可是。。可是。。。俺也有一颗侠骨柔肠的心啊～～～

L*t2010-12-15 08:12

30 楼

你这记性。。。不如以前了啊。还没有到 Leeds。
哈哈。

【在 J********a 的大作中提到】

: 你说的难道是leeds U？

m*z2010-12-15 08:12

31 楼

你是必须要做结构吗？如果是对于一个新蛋白，做一些基本的biochemistry
characterization不可以吗？

【在 b******3 的大作中提到】

: 楼上几位都太给力了，能不能给一些文献参考一下！这个19K的蛋白，还只是一个
: domain，还是预测的序列，如果还是多聚，我就不用毕业了。

n*22010-12-15 08:12

32 楼

谢谢！

【在 q********g 的大作中提到】

: 多数情况最有力的就是诚实。
: 愿你老爸早日来美。

s*i2010-12-15 08:12

33 楼

难道你没有机会展示侠骨柔肠？
要么我去求bless，你帮我发圈包子，嗬嗬

不好接触的感觉。。可是。。可是。。。俺也有一颗侠骨柔肠的心啊～～～

【在 E**********T 的大作中提到】

b*k2010-12-15 08:12

34 楼

好像没太大的区别我觉得，我觉得英国除了大城市，好多这种很田园的地方
当然我发的照片是湖区，算风景区，尤其漂亮些

【在 L******t 的大作中提到】

: 是不是越往北越这样？
: 比方说 Scotland

s*72010-12-15 08:12

35 楼

貌似没这么简单吧

【在 m**z 的大作中提到】

: 你是必须要做结构吗？如果是对于一个新蛋白，做一些基本的biochemistry
: characterization不可以吗？

W*u2010-12-15 08:12

36 楼

I believe my parents' case would encourage you a lot. My parents stayed with
me for 6 months and went back to china at the end of October. They just
came back to US on Jan 31st. The customer officer gave them another 6 month
to stay.

E*T2010-12-15 08:12

37 楼

你这个包子控！！
我好不容易攒点儿包子。我容易嘛？？？？？？？？？、

【在 s*******i 的大作中提到】

: 难道你没有机会展示侠骨柔肠？
: 要么我去求bless，你帮我发圈包子，嗬嗬
:
: 不好接触的感觉。。可是。。可是。。。俺也有一颗侠骨柔肠的心啊～～～

b*32010-12-15 08:12

38 楼

就是做结构的。。。
CD谱蛋白浓度多少？1mg/mL行不？主要是盐浓度有50mM phosphate，有问题没？

【在 m**z 的大作中提到】

: 你是必须要做结构吗？如果是对于一个新蛋白，做一些基本的biochemistry
: characterization不可以吗？

s*i2010-12-15 08:12

39 楼

不容易！！！
不好意思，一看到包子比我多的就想均贫富

【在 E**********T 的大作中提到】

: 你这个包子控！！
: 我好不容易攒点儿包子。我容易嘛？？？？？？？？？、

m*z2010-12-15 08:12

40 楼

CD需要的蛋白量是很少的，一般~10 uM,就可以了，体积应该是400-500ul的样子，不同
的仪器和cuvette可能会不同。50 mM phosphate有一点高，另外NaCl也会影响。不过这
些影响主要都在far UV region (180-200nm).对于看二级结构的话应该影响不大

【在 b******3 的大作中提到】

: 就是做结构的。。。
: CD谱蛋白浓度多少？1mg/mL行不？主要是盐浓度有50mM phosphate，有问题没？

b*k2010-12-15 08:12

41 楼

晕，patpat，哈哈

【在 E**********T 的大作中提到】

: 你突然出现。。吓人啊？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？

s*n2010-12-15 08:12

42 楼

过一个简单的size exclusion就知道是否多聚了，没必要这么复杂吧？

【在 p****s 的大作中提到】

: 测测correlation time，也许知道是不是多聚了。我觉得是多聚的可能性比较大，就算
: 是没折叠的，也不会峰很少
: 要不做做H-C HMQC，不过估计比较贵，哈哈

m*z2010-12-15 08:12

43 楼

做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件
，包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高，不过还是可以一试。
还有就是你的HSQC是什么温度run的呢？如果只是25度的话，试试看提高温度到35甚至
40度，也许能有好一点的谱也不一定（当然你的蛋白要够稳定。。。）
我不是做结构的，不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的
时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温
度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的
话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多，不过还是
不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得
益于你对这个蛋白性质的了解得。
或者能不能同时也试试看crystal呢？也许能多一点机会。

【在 b******3 的大作中提到】

: 就是做结构的。。。
: CD谱蛋白浓度多少？1mg/mL行不？主要是盐浓度有50mM phosphate，有问题没？

s*n2010-12-15 08:12

44 楼

外行请问NMR能够在高温下做么？比如60-100 degree C.

【在 m**z 的大作中提到】

: 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件
: ，包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高，不过还是可以一试。
: 还有就是你的HSQC是什么温度run的呢？如果只是25度的话，试试看提高温度到35甚至
: 40度，也许能有好一点的谱也不一定（当然你的蛋白要够稳定。。。）
: 我不是做结构的，不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的
: 时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温
: 度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的
: 话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多，不过还是
: 不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得
: 益于你对这个蛋白性质的了解得。

b*32010-12-15 08:12

45 楼

我们老板的意思是基本上提出来不折叠就不折叠了，废那个劲换buffer，调温度，不如
直接换个sequence再试。唉，再撞撞运气吧。多谢了。

【在 m**z 的大作中提到】

m*z2010-12-15 08:12

46 楼

那么高倒是没有听说过... 蛋白的话那么高温度能稳定不沉淀嘛。。

【在 s********n 的大作中提到】

: 外行请问NMR能够在高温下做么？比如60-100 degree C.

p*s2010-12-15 08:12

47 楼

我见过有70度条件下做的，但是取决于蛋白。如果蛋白在那个温度下要变性自然就不行了

【在 s********n 的大作中提到】

: 外行请问NMR能够在高温下做么？比如60-100 degree C.

p*s2010-12-15 08:12

48 楼

提高温度是提高分子tumbling的速度，减小correlation time，延长弛豫时间，嗯
可能还是分子量太大了，25k以上似乎就要用一些特殊手段来做

【在 m**z 的大作中提到】

o*e2010-12-15 08:12

49 楼

楼主做CD怕信号小的话，可以用path length大些的cuvette。
（不过需要的volume也要相对多一点儿）

【在 m**z 的大作中提到】

: CD需要的蛋白量是很少的，一般~10 uM,就可以了，体积应该是400-500ul的样子，不同
: 的仪器和cuvette可能会不同。50 mM phosphate有一点高，另外NaCl也会影响。不过这
: 些影响主要都在far UV region (180-200nm).对于看二级结构的话应该影响不大

s*n2010-12-15 08:12

50 楼

我有一个热稳定的蛋白，Tm>90C，在70和90C有一些不同的特性，通过MD simulation发
现蛋白结构的一些区域在不同温度下有一些有意思的现象，比如说有几个区域在90度
RMSF比在70C下大很多（这很正常），但有一个区域70C比90C大很多，这个现象可能可
以和这个蛋白在这两个温度下的不同特性相联系。
现在就是除了做mutation外，能否用一些生物物理的方法来检测。CD是可以检测整个蛋
白的构象变化，但好像不能检测到区域。所以想问问NMR能否在高温下做？现在能够做
到多大蛋白（我的蛋白大概35 kda）？NMR能否检测到蛋白结构中不同区域的变化？

行了

【在 p****s 的大作中提到】

: 我见过有70度条件下做的，但是取决于蛋白。如果蛋白在那个温度下要变性自然就不行了

p*s2010-12-15 08:12

51 楼

我觉得大小不成问题...但是能做那么高温度的NMR仪器估计不好找，问问你所在学校吧
70-90C的条件下，蛋白转得很快了吧，35kd应该很合适。NMR可以做很高分辨的东西，
比如CPMG可以做每个残基的动
力学变化。我觉得关键还是有没有能做这么高温度的仪器。

【在 s********n 的大作中提到】

: 我有一个热稳定的蛋白，Tm>90C，在70和90C有一些不同的特性，通过MD simulation发
: 现蛋白结构的一些区域在不同温度下有一些有意思的现象，比如说有几个区域在90度
: RMSF比在70C下大很多（这很正常），但有一个区域70C比90C大很多，这个现象可能可
: 以和这个蛋白在这两个温度下的不同特性相联系。
: 现在就是除了做mutation外，能否用一些生物物理的方法来检测。CD是可以检测整个蛋
: 白的构象变化，但好像不能检测到区域。所以想问问NMR能否在高温下做？现在能够做
: 到多大蛋白（我的蛋白大概35 kda）？NMR能否检测到蛋白结构中不同区域的变化？
:
: 行了

m*z2010-12-15 08:12

52 楼

re 这个。只要有合适的NMR,纯化一些N15-label的蛋白，试试看，也许就能知道有没有
希望work了。这个从时间和钱上面来讲都不算需要花费很多。

【在 p****s 的大作中提到】

: 我觉得大小不成问题...但是能做那么高温度的NMR仪器估计不好找，问问你所在学校吧
: 70-90C的条件下，蛋白转得很快了吧，35kd应该很合适。NMR可以做很高分辨的东西，
: 比如CPMG可以做每个残基的动
: 力学变化。我觉得关键还是有没有能做这么高温度的仪器。

C*m2010-12-15 08:12

53 楼

到了70度，amide proton的交换非常快，用15N标记估计也看不到什么东西。

【在 m**z 的大作中提到】

: re 这个。只要有合适的NMR,纯化一些N15-label的蛋白，试试看，也许就能知道有没有
: 希望work了。这个从时间和钱上面来讲都不算需要花费很多。

s*n2010-12-15 08:12

54 楼

像这种情况表达的蛋白需要C13和N15都标记吗？

s*n2010-12-15 08:12

55 楼

这个是什么意思？NMR不是检测H1, N15和C13么？

【在 C*********m 的大作中提到】

: 到了70度，amide proton的交换非常快，用15N标记估计也看不到什么东西。

p*s2010-12-15 08:12

56 楼

好像也可以做的，不一定会被交换掉。对于常用的HSQC来说，是从H开始到N然后再到H，靠的是J-
coupling，而一开始的信号来自amide上的H，amide上的H可以和水交换。如果交换速度
太快，这个H就观测不到了。不过看起来如果有氢键（二级结构）存在的话，交换速度会慢很多。别
的常用的3D NMR方法都是建立在HSQC的基础上。你可以看看下面的文章，一个49kD的蛋白（寡聚），
在80C条件下做的。
http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/ja1064608

【在 s********n 的大作中提到】

: 这个是什么意思？NMR不是检测H1, N15和C13么？

p*s2010-12-15 08:12

57 楼

如果没有以前的assignments必须用C13，否则没法进行assignment。说不定还要用D

【在 s********n 的大作中提到】

: 像这种情况表达的蛋白需要C13和N15都标记吗？

s*n2010-12-15 08:12

58 楼

我大概查了一下，Brown U好像可以做到-150 to 160 C，还有其他几个Universities也
可以做。
有几个问题想请教一下：
1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label，有的用D2/C13 label，这是两个实验么？
还是说这个蛋白需要用三种标记？
2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O?
3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么？比如说是否需要杜绝带有N14/C12
的试剂？
4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间？我在考虑是否值得花这么大的力气去做。

H，靠的是J-
度会慢很多。别
蛋白（寡聚），

【在 p****s 的大作中提到】

: 好像也可以做的，不一定会被交换掉。对于常用的HSQC来说，是从H开始到N然后再到H，靠的是J-
: coupling，而一开始的信号来自amide上的H，amide上的H可以和水交换。如果交换速度
: 太快，这个H就观测不到了。不过看起来如果有氢键（二级结构）存在的话，交换速度会慢很多。别
: 的常用的3D NMR方法都是建立在HSQC的基础上。你可以看看下面的文章，一个49kD的蛋白（寡聚），
: 在80C条件下做的。
: http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/ja1064608

m*z2010-12-15 08:12

59 楼

here are what i know:
1. D2 label是对于比较大的蛋白质比较有用的方法。我觉得第一步通常只是N15标记，
这个便宜。然后根据得到的结果考虑要不要继续以及如何继续。要做assignment,N15/
C13-label是必须的。D2 根据需要把
2&3.no special reagen required during purification, otherwise it will be way
too expensive.
4.纯化过程并无区别，蛋白的表达可能需要优化。如果你的蛋白在LB表达很好的话，应
该不用担心。当然D2 标记的话可能还要考虑e.coli的grow.具体要参考文献。我只做过
N15label，其他的都是实验室其他人做的。我也不清楚如果一切顺利的话，从开始到
assignment到得到你需要的数据需要多久。。。

C12

【在 s********n 的大作中提到】

: 我大概查了一下，Brown U好像可以做到-150 to 160 C，还有其他几个Universities也
: 可以做。
: 有几个问题想请教一下：
: 1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label，有的用D2/C13 label，这是两个实验么？
: 还是说这个蛋白需要用三种标记？
: 2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O?
: 3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么？比如说是否需要杜绝带有N14/C12
: 的试剂？
: 4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间？我在考虑是否值得花这么大的力气去做。
:

p*s2010-12-15 08:12

60 楼

1. 没看文章不清楚，我觉得应该是大部分样品都是D,13C和15N标记
2. 纯化过程是用普通水，表达过程中用重水
3. 不需要，都是蛋白呀，C和N在蛋白里是稳定的原子，不会和别的发生交换。amide H
(D)和OH的
H(D)可以与水中的H交换，这也是D代蛋白里HSQC的H信号的来源
4. 不知道需要多少时间，取决于你的谱的质量，你可以先用D和15N标记看看HSQC的谱
怎么样。或者不
用D先看看。如果峰特窄的话就有往下面做的意义，不过我觉得基本没什么问题。其实
我没做过
solution NMR解谱...一般的蛋白从得到谱算一个月怎么样都能解出来了。不过你的蛋
白太大，我估
计可能要用一些4D的方法吧。

C12

【在 s********n 的大作中提到】

p*s2010-12-15 08:12

61 楼

我建议你找一个NMR合作者，这点东西如果不是专门做NMR的不会投入很大精力。做出来
你们都有
credit,做不出来你也不亏什么。
你可以做做别的生化和生物物理，比如CD，热变性什么的。如果想得到残基尺度的动力
学信息，做NMR
是最好了。（其实别的生物物理方法我也不是懂太多...）

C12

【在 s********n 的大作中提到】

m*z2010-12-15 08:12

62 楼

同意。都自己来的话，就算谱图都好，那些软件什么的都得捉摸挺长时间。那些东西都
学会，在作出需要的结果，都快大半个PhD了。。。

【在 p****s 的大作中提到】

: 我建议你找一个NMR合作者，这点东西如果不是专门做NMR的不会投入很大精力。做出来
: 你们都有
: credit,做不出来你也不亏什么。
: 你可以做做别的生化和生物物理，比如CD，热变性什么的。如果想得到残基尺度的动力
: 学信息，做NMR
: 是最好了。（其实别的生物物理方法我也不是懂太多...）
:
: C12

m*z2010-12-15 08:12

63 楼

H-D exchange mass-spec is another way for dynamics study.

【在 p****s 的大作中提到】

p*s2010-12-15 08:12

64 楼

也可以用HX NMR，哈哈
总觉得mass spec分辨率不太好，嗯，当然跟NMR好像是互补的

【在 m**z 的大作中提到】

: H-D exchange mass-spec is another way for dynamics study.

m*z2010-12-15 08:12

65 楼

那是啊，这不是在寻找alternative method嘛。。。：）

【在 p****s 的大作中提到】

: 也可以用HX NMR，哈哈
: 总觉得mass spec分辨率不太好，嗯，当然跟NMR好像是互补的

s*n2010-12-15 08:12

66 楼

Thank mmzz and prales!
我就不一一回复了，你们的回帖解决了我的大部分疑问，如果我决定做的话肯定是找合
作者的，我也就了解一下原理和背景就行了。我也想用其他的生物物理的方法，但就我
所知好像没有其他特别合适的（H-D exchange mass-spec能够检测到residue么？）。
我的蛋白表达量挺高的，纯化也很简单（一步），希望在我可控的范围内不会有太大的
问题。呵呵！

m*z2010-12-15 08:12

67 楼

H-D exchange mass-spec是可以做到residue specific的，但不能cover整个蛋白，
coverage可能在70-80%就不错了，分辨率和coverage取决于蛋白非特异性酶切后产生的
片断的overlap.

【在 s********n 的大作中提到】

: Thank mmzz and prales!
: 我就不一一回复了，你们的回帖解决了我的大部分疑问，如果我决定做的话肯定是找合
: 作者的，我也就了解一下原理和背景就行了。我也想用其他的生物物理的方法，但就我
: 所知好像没有其他特别合适的（H-D exchange mass-spec能够检测到residue么？）。
: 我的蛋白表达量挺高的，纯化也很简单（一步），希望在我可控的范围内不会有太大的
: 问题。呵呵！

s*n2010-12-15 08:12

68 楼

I really appreciate your help!

【在 m**z 的大作中提到】

: H-D exchange mass-spec是可以做到residue specific的，但不能cover整个蛋白，
: coverage可能在70-80%就不错了，分辨率和coverage取决于蛋白非特异性酶切后产生的
: 片断的overlap.