【急】10包子求教: 如何将DNA的两条互补链分开 - 未名空间MITBBS历史存档

【急】10包子求教: 如何将DNA的两条互补链分开# Biology - 生物学

B*M2011-02-05 08:02

1 楼

【以下文字转载自 ebiz 讨论区】
发信人: BRCM (BRCM), 信区: ebiz
标题: [BSSD]今天发现当年错过了一个少奋斗50年的机会
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Apr 21 21:50:11 2012, 美东)
当年刚刚大学毕业，考过了GT，先回老家在市政府混了个公务员，一边准备申请学校。
不久后认识了一个我们市的网友，说是网友，其实也就是在网上认识，后来就成了朋友
了。当时因为上班闲得慌，就在新浪什么什么缘的交友网站上注册了个帐号，然后找本
地的女网友（当时是2000年，上网的人不多，大家还比较纯情，找网友还主要是泡妞，
不象现在主要是打炮，呵呵），结果发现一个长得挺清秀的女生，就联系了一下，后来
在icq上聊，聊得不错，而且发现不少共同点，而且我们爷爷辈都还互相认识。
于是后来就决定见面，约在pizza hut吃饭，在门口我打了个电话给她，就发现边上一
个长头发女孩停下摩托车拿出一个V998，这款moto手机当年红极一时，刚出来到1万多
，那时候稍微降了一点，也要8000千左右，当时我们那里的房价也才1000出头一平。我
自己是1千多买了个二手moto翻盖，这种高档货我是想也不敢想的。所以就知道了她是
个富二代。不过当年富二代不象现在这么张扬，大家也没有太当一回事。那天在pizza
hut聊了一晚上，对她感觉挺好。也知道她是独生女，她们家自己开厂，生产并出口包
袋。
后来交往多了，成了好朋友，也知道还有另一个跟她关系不错的网友，是四川一个烂校
刚毕业的大学生，离我们那里有十万八千里。我知道那个网友对她有意思，所以我当时
想是不是要先下手为强，虽然我们家是普通家庭，但是当时我的学历和工作单位还是响
当当的，再加上近水楼台，我如果发动攻势，不敢说100%的把握，起码80%打败那个四
川仔应该是没问题的。不过当时我探了探她的口风，问她有没有以后出国的想法，她说
对出国没什么兴趣，而那时我美国的offer刚好拿到了，心里开始犹豫。那时候还是年
轻，心高气傲，一心想来美国干出点大事，不愿意为女孩放弃这样的机会，所以和她就
一直保持着朋友的关系，直到有一天她打电话给我告诉我她网恋了，对方就是那个四川
的网友。我心里很不是滋味，但是也没有多说什么，问了问那个男生的情况就互道晚安
了。过了一阵子，她告诉我那个网友竟然一个人来到我们那里找工作，她就让她爸在公
司里给他安排了一个位置。再后来，我来了美国，跟她的联系也就慢慢少了。
昨天在其它版面谈到诺基亚和moto当年的辉煌，我猛然想起了当年这段往事，特别是那
晚她拿出手机接电话那个画面。于是就google了一下看看能不能找到她现在在干什么，
结果发现她现在还是在她爸的公司上班。好奇之余就又google了一下她爸的公司，这下
才发现她们家的公司已经从包袋做到其它行业了，但是包袋还是主业，光包袋这个公司
去年主营收入2个多亿，是我们市的纳税大户。
现在想想，当年她们家应该就是大户了，可惜当年没有google,估计也无从知道她们家
做得多大。当年如果追到她，应该可以少奋斗50年了。人生还真是挺有意思的。

l*e2011-02-05 08:02

2 楼

周五离开的时候还好好的，今天回来发现机器不工作了，换了CPU一切正常。
这个CPU才用了半年，有没有兄弟有这方面的经验。
谢谢了。

a*a2011-02-05 08:02

3 楼

看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
万分感谢！

L*s2011-02-05 08:02

4 楼

这个可行的,说实话我也错过一次这样的机会..

s*y2011-02-05 08:02

5 楼

操频操死了？

r*d2011-02-05 08:02

6 楼

多长的链？

【在 a*****a 的大作中提到】

: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！

l*e2011-02-05 08:02

7 楼

超过，不过不是死在这上面的，
不知怎么死的。

【在 s*********y 的大作中提到】

: 操频操死了？

a*a2011-02-05 08:02

8 楼

一条30bp，一条40bp, 中间30bp为互补序列，Tm76度

【在 r********d 的大作中提到】

: 多长的链？

a*i2011-02-05 08:02

9 楼

没搞过。不过应该不会太复杂，直接打电话给Intel的售后服务问问吧。

s*n2011-02-05 08:02

10 楼

If you know the sequences of them, just synthesize them, :)

l*e2011-02-05 08:02

11 楼

thanks
chatting online, and got a RMA number.
Will mail it back and wait for another one.

M*n2011-02-05 08:02

12 楼

even if they are 300bp 400bp it won't cost that much to have them
synthesized.

l*e2011-02-05 08:02

13 楼

chat online, got a order number and sent them last Thursday. And just after
one week I got a new one back in a retail box today.

a*a2011-02-05 08:02

14 楼

Separating the strands is for analysis.

【在 s********n 的大作中提到】

: If you know the sequences of them, just synthesize them, :)

a*i2011-02-05 08:02

15 楼

cool...

z*t2011-02-05 08:02

16 楼

如果你怀疑Tm值过高的话，可以试试增大甲醛浓度，改变盐浓度降低Tm值。

【在 a*****a 的大作中提到】

: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！

s*n2011-02-05 08:02

17 楼

Do you know where I could order these 300-400 bp oligos? I only find IDT
could synthesize <=200 bp.

【在 M*****n 的大作中提到】

: even if they are 300bp 400bp it won't cost that much to have them
: synthesized.

s*n2011-02-05 08:02

18 楼

So how did you get these products? PCR?

【在 a*****a 的大作中提到】

: Separating the strands is for analysis.

a*a2011-02-05 08:02

19 楼

你是指增大formamide的浓度？
不知道这个会不会导电？会不会导致电泳的时候样品进胶不好？

【在 z*t 的大作中提到】

: 如果你怀疑Tm值过高的话，可以试试增大甲醛浓度，改变盐浓度降低Tm值。

a*a2011-02-05 08:02

20 楼

As you said, synthesize them, and mix together...

【在 s********n 的大作中提到】

: So how did you get these products? PCR?

s*n2011-02-05 08:02

21 楼

I am not clear why you want to separate them since you already have the
synthesized ones, just curious, :)

【在 a*****a 的大作中提到】

: As you said, synthesize them, and mix together...

a*k2011-02-05 08:02

22 楼

genscript can do that, less than $0.5 per bp for large gene synthesis. We
had a 6kb gene synthesized by them, correct clone.

【在 s********n 的大作中提到】

: Do you know where I could order these 300-400 bp oligos? I only find IDT
: could synthesize <=200 bp.

a*k2011-02-05 08:02

23 楼

they should be doing some biophysics. I know someone doing DNA penetration
and diffusion studies on lipid membranes.

【在 s********n 的大作中提到】

: I am not clear why you want to separate them since you already have the
: synthesized ones, just curious, :)

z*t2011-02-05 08:02

24 楼

对，我就是根据DNA Tm值来说，具体跑胶的话没有试过:)

【在 a*****a 的大作中提到】

: 你是指增大formamide的浓度？
: 不知道这个会不会导电？会不会导致电泳的时候样品进胶不好？

s*s2011-02-05 08:02

25 楼

你加热以后怎么降温的？
49%的formamide很强了，差不多能降35C，加热95就算1k的都该分开了

【在 a*****a 的大作中提到】

: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！

w*n2011-02-05 08:02

26 楼

应该挺简单的,照这个配下buffer https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/
US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603425 sample 95度3-5分钟，不用30分钟,
那是给大片段用的,200以下SSR之类的5分钟就够了,时间太长了引起降解(大片段掉俩bp
看不出来),确实会出N条带，冰上放一会儿(把泳道吹干净了),尥蹶子跑吧.然后染色,切
胶回收，（一条30bp，一条40bp是很大的差异了，一般差2bp就可以保证质量了）。

【在 a*****a 的大作中提到】

: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！

a*a2011-02-05 08:02

27 楼

用PCR仪设定95度30分钟，完成后立刻降温到4度

【在 s******s 的大作中提到】

: 你加热以后怎么降温的？
: 49%的formamide很强了，差不多能降35C，加热95就算1k的都该分开了

c*62011-02-05 08:02

28 楼

你这样的条件足够强了，没有道理分不开
可能是你的urea gel不够好，我用过的invitrogen和biorad的precast gel的
denaturation效果都不如自己配置的8M的acrylamide gel好
然后，我觉得0.05M的NaOH 95C 30min 可能太强了，多条带有可能和DNA的degradation
有关吧

【在 a*****a 的大作中提到】

: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！

T*t2011-02-05 08:02

29 楼

可以用PCR仪来加热，但是不应该用PCR仪来冷却。那个降温速度太慢了，还是会有部分
双链anneal上的。而且30分钟太长了，你只有30bp的互补区，加热5分钟基本就够了。
如果你用PCR仪加热，设定95度大于5分钟，六七分钟或者更长都行，等样品加热满了5
分钟之后，立即取出管子放到冰上，这样才叫snap cool。

【在 a*****a 的大作中提到】

: 用PCR仪设定95度30分钟，完成后立刻降温到4度

s*s2011-02-05 08:02

30 楼

//nod. 正是我要说的。

5

【在 T**********t 的大作中提到】

: 可以用PCR仪来加热，但是不应该用PCR仪来冷却。那个降温速度太慢了，还是会有部分
: 双链anneal上的。而且30分钟太长了，你只有30bp的互补区，加热5分钟基本就够了。
: 如果你用PCR仪加热，设定95度大于5分钟，六七分钟或者更长都行，等样品加热满了5
: 分钟之后，立即取出管子放到冰上，这样才叫snap cool。

k*s2011-02-05 08:02

31 楼

【在 a*****a 的大作中提到】

: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！

k*s2011-02-05 08:02

32 楼

用formamide最好，但一定要用高纯度的。建议用ABI的Hi-Di formamide (Cat#:
4311320).
DNA 样品沉淀干燥后用20ul formamide，然后96度2min，接着放冰上10分钟就可以。肯
定完全变性。
另外一个办法，就是1ul样品加上19ul formamide (最少9ul），96度2min，接着放冰上
10分钟就可以。
检测可以跑6% PAGE胶，TBE/TAE buffer.

【在 a*****a 的大作中提到】

: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！

a*a2011-02-05 08:02

33 楼

谢谢大家的指点，根据楼上各位的办法我都试了试，都挺好用的。非常感谢！
发信人: wangbin (wangbin), 信区: Biology
应该挺简单的,照这个配下buffer https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/
US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603425 sample 95度3-5分钟，不用30分钟,
那是给大片段用的,200以下SSR之类的5分钟就够了,时间太长了引起降解(大片段掉俩bp看不
出来),确实会出N条带，冰上放一会儿(把泳道吹干净了),尥蹶子跑吧.然后染色,切胶回收，
（一条30bp，一条40bp是很大的差异了，一般差2bp就可以保证质量了）。
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发信人: ThisjobIwant (这活我来干), 信区: Biology
可以用PCR仪来加热，但是不应该用PCR仪来冷却。那个降温速度太慢了，还是会有部分
双链anneal上的。而且30分钟太长了，你只有30bp的互补区，加热5分钟基本就够了。
如果你用PCR仪加热，设定95度大于5分钟，六七分钟或者更长都行，等样品加热满了5
分钟之后，立即取出管子放到冰上，这样才叫snap cool。
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发信人: keytoiris (genemap), 信区: Biology
用formamide最好，但一定要用高纯度的。建议用ABI的Hi-Di formamide (Cat#:
4311320). DNA 样品沉淀干燥后用20ul formamide，然后96度2min，接着放冰上10分钟就可
以。肯定完全变性。另外一个办法，就是1ul样品加上19ul formamide (最少9ul），
96度2min，接着放冰上10分钟就可以。检测可以跑6% PAGE胶，TBE/TAE buffer.
=================================================================

【在 a*****a 的大作中提到】

: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！

s*n2011-02-05 08:02

34 楼

Thanks. Actually I know these companies for gene synthesis. However, I am
looking for those who could synthesize oligos as long as possible. Now I
only know IDT could synthesize 200 bp oligos with confidence.

【在 a********k 的大作中提到】

: genscript can do that, less than $0.5 per bp for large gene synthesis. We
: had a 6kb gene synthesized by them, correct clone.