F*K
2 楼
最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
谢谢。
载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
谢谢。
b*m
3 楼
仿佛维纳那声音听起来更old school一点，贝娜更流行范一点？
【在 b*********m 的大作中提到】
: 贝娜和维娜的都听过，不知为什么喜欢后者。
【在 b*********m 的大作中提到】
: 贝娜和维娜的都听过，不知为什么喜欢后者。
C*m
4 楼
经常碰到，可能翻译提前终止了，可能被降解了，剩了GST
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
s*s
5 楼
多半降解了，很正常。试试不一样的条件长，GST换个位置
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
s*y
6 楼
能不能把GST放在c-term?
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
v*d
7 楼
可以试一下：25-28（RT）摇菌，induce的时候OD提高，时间缩短
BTW，double check your E. coli strain
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
BTW，double check your E. coli strain
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
H*g
8 楼
Sorry have to type in English.
Do you have antibody targeted to your fusion protein?
Do you have antibody targeted to your fusion protein?
b*y
9 楼
If you still see some full length product, put a His tag at the C-terminus.
Using Ni first and then glutathione sepharose next. You will produce some
good stuff. Due to dimeric nature of GST, it is still not ideal.
If you can, make a MBP-YPI-His. Using Ni first and Amylose second, you will
get pure protein. And the yield can be enhanced as well.
Good luck!
Using Ni first and then glutathione sepharose next. You will produce some
good stuff. Due to dimeric nature of GST, it is still not ideal.
If you can, make a MBP-YPI-His. Using Ni first and Amylose second, you will
get pure protein. And the yield can be enhanced as well.
Good luck!
H*g
10 楼
Does Maltose Binding Protein tag also have the dimerization issue?
In his case, I guess he needs to determine whether his protein really got
expressed or not, before considering any possibility of degradation, etc.
.
will
【在 b******y 的大作中提到】
: If you still see some full length product, put a His tag at the C-terminus.
: Using Ni first and then glutathione sepharose next. You will produce some
: good stuff. Due to dimeric nature of GST, it is still not ideal.
: If you can, make a MBP-YPI-His. Using Ni first and Amylose second, you will
: get pure protein. And the yield can be enhanced as well.
: Good luck!
In his case, I guess he needs to determine whether his protein really got
expressed or not, before considering any possibility of degradation, etc.
.
will
【在 b******y 的大作中提到】
: If you still see some full length product, put a His tag at the C-terminus.
: Using Ni first and then glutathione sepharose next. You will produce some
: good stuff. Due to dimeric nature of GST, it is still not ideal.
: If you can, make a MBP-YPI-His. Using Ni first and Amylose second, you will
: get pure protein. And the yield can be enhanced as well.
: Good luck!
b*y
11 楼
No, MBP is largely a monomer.
He said "主带总是在25kd". I am guessing that there are minor bands and one
of them is the full length product. If no full length product at all due to
degradation, it is hard to help out here.
He said "主带总是在25kd". I am guessing that there are minor bands and one
of them is the full length product. If no full length product at all due to
degradation, it is hard to help out here.
v*m
12 楼
这个非常常见，如果你的蛋白表达后没有稳定的结构。
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
T*i
13 楼
还有一种可能，你的full length fusion protein 大多在inclusion body里。
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
【在 F*K 的大作中提到】
: 最近表达纯化一个65kd的蛋白，GST tag，但主带总是在25kd， 应该是GST本身。
: 载体测序验证无误，目的基因前没有终止子，请问是什么原因导致融合蛋白断裂？
: 谢谢。
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