请ChIP专家帮我看看sonicating的问题 - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

请ChIP专家帮我看看sonicating的问题

请ChIP专家帮我看看sonicating的问题# Biology - 生物学

F*k2012-01-10 08:01

1 楼

han~~~ 2年前买的dockstar要拿出来用了，有问题请教大家:
1. 装debian好还是arch linux好？
2. 能实现这功能么：如果一段时间硬盘没有activity就自动spin down。如果能，需
要自己装什么软件来实现还是dockstar本身就有这个功能？
谢谢大家！

n*22012-01-10 08:01

2 楼

图片从左到右依次是0、3、6、9、12、15、18 sonicating cycles。始终有大的DNA片
断，而且小片段富集也不明显。是什么原因？

l*l2012-01-10 08:01

3 楼

arch linux好装，debian更强大写，不过小毛病不少。不想折腾的就上arch吧。
spin - down。arch自带

s*s2012-01-10 08:01

4 楼

做到36再看吧
btw, marker连size都不标

【在 n******2 的大作中提到】

: 图片从左到右依次是0、3、6、9、12、15、18 sonicating cycles。始终有大的DNA片
: 断，而且小片段富集也不明显。是什么原因？

F*k2012-01-10 08:01

5 楼

明白了, 多谢员外！

【在 l********l 的大作中提到】

: arch linux好装，debian更强大写，不过小毛病不少。不想折腾的就上arch吧。
: spin - down。arch自带

n*22012-01-10 08:01

6 楼

加了size.

【在 n******2 的大作中提到】

: 图片从左到右依次是0、3、6、9、12、15、18 sonicating cycles。始终有大的DNA片
: 断，而且小片段富集也不明显。是什么原因？

k*e2012-01-10 08:01

7 楼

我用的是dockstar自带的OS，怎么弄spin down？需要外接硬盘支持才行吗？

【在 l********l 的大作中提到】

: arch linux好装，debian更强大写，不过小毛病不少。不想折腾的就上arch吧。
: spin - down。arch自带

s*s2012-01-10 08:01

8 楼

大小差不多啊。18已经有点不错的趋势啦，再接再厉，你还远远不够
不要参考别人paper上的cycle, 机器设置可能差很多的。

【在 n******2 的大作中提到】

: 加了size.

l*l2012-01-10 08:01

9 楼

用内置的hdparm设置spin down时间就是了

【在 k***e 的大作中提到】

: 我用的是dockstar自带的OS，怎么弄spin down？需要外接硬盘支持才行吗？

s*s2012-01-10 08:01

10 楼

btw, 你可以试一下MNase，感觉这个干净很多

【在 s******s 的大作中提到】

: 大小差不多啊。18已经有点不错的趋势啦，再接再厉，你还远远不够
: 不要参考别人paper上的cycle, 机器设置可能差很多的。

p*m2012-01-10 08:01

11 楼

arch linux比原来的系统好在哪里呢？破解后pogoplug网站上还可以看见吗？
hd的读写会快吗？

j*t2012-01-10 08:01

12 楼

Sonicator的功率是否够强？
SDS加得够吗？
可以试一下这个lysis buffer:
Lysis Buffer:
Consists of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA,
0.5 mM EGTA, 0.1% Na-Deoxycholate, 0.5% N-lauroylsarcosine, 1× protease
inhibitors
建议follow几个nature protocol 的文章试试！

t*d2012-01-10 08:01

13 楼

原来的系统就挺好。可以写个script让硬盘自动spin down

w*r2012-01-10 08:01

14 楼

要把DNA上的蛋白弄掉再跑胶。
否则DNA上面结合着蛋白size没法看

C*Y2012-01-10 08:01

15 楼

This buffer look good to me. Use this buffer to figure out the best
condition with your sonicator.

【在 j****t 的大作中提到】

: Sonicator的功率是否够强？
: SDS加得够吗？
: 可以试一下这个lysis buffer:
: Lysis Buffer:
: Consists of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA,
: 0.5 mM EGTA, 0.1% Na-Deoxycholate, 0.5% N-lauroylsarcosine, 1× protease
: inhibitors
: 建议follow几个nature protocol 的文章试试！

g*f2012-01-10 08:01

16 楼

我估计你是sonication 后直接拿来跑胶的。你得完全按照ChIP的样品处理方法reverse
crosslink 后用 phenol chloroform 纯化DNA 后再跑胶，你就会看到富集的小片段了
，而不是smear

n*22012-01-10 08:01

17 楼

Thanks a lot for the suggestions.
However, the DNA samples shown here were already after the step of reverse-
cross linking.

n*22012-01-10 08:01

18 楼

output is 5-6 watt. Can't go higher since it will produce bubbles easily.
final concentration of SDS is 0.8%.

【在 j****t 的大作中提到】

n*22012-01-10 08:01

19 楼

Do you sonicate the cells in Lysis buffer?

【在 j****t 的大作中提到】

s*s2012-01-10 08:01

20 楼

你直接在lysis buffer里面sonicate的？我们都是在TE+EGTA里面，
不是很容易起bubble

【在 n******2 的大作中提到】

: output is 5-6 watt. Can't go higher since it will produce bubbles easily.
: final concentration of SDS is 0.8%.

n*22012-01-10 08:01

21 楼

No, my sonicating buffer is slightly different from lysis buffer.
They both contain low concentration of Tris, NaCl, MgCl2, CaCl2, however,
sonicating buffer consists of higher amount of IGEPAL4% (compare to 0.5% in
lysis B) and 0.8% SDS.
I'm following the protocol developed by Affymatrix. It worked well on mouse
cells performed by another lab, but bothers me very much on my human cell
line.

【在 s******s 的大作中提到】

: 你直接在lysis buffer里面sonicate的？我们都是在TE+EGTA里面，
: 不是很容易起bubble

j*t2012-01-10 08:01

22 楼

我的sonication 步骤如下，具体输出功率不详（可以参考Branson的说明书）。0.8%
SDS 应该足够强了.我用的是0.1% of Na-deoxycholate and 0.2% of sarkosyl （以前
用过0.5% of sarkosyl）。我有时候看lysate是否clear了，来决定sonication的次数。
Sonicate sample (in a 15 ml falcon tube) using Branson 450 sonicator (Power
Set 2 or 4, duty cycle 100%, 4-6 times, 30 sec each with 1 min interval).
During the sonication, keep falcon tube in a 50 ml beaker filled with ice.

【在 n******2 的大作中提到】

: output is 5-6 watt. Can't go higher since it will produce bubbles easily.
: final concentration of SDS is 0.8%.

j*t2012-01-10 08:01

23 楼

我是在这个lysis buffer里作sonication的。我现在用0.2% sarkosyl（instead of 0.
5%）,和 1% of Na-deoxycholate。sonication的效果很好。而且这个浓度的detegent
对于IP 来说还是高了些，我会在做IP前把sample稀释一倍。
我觉得你的lysis和sonication 的条件也许可以了，问题说不定是在reverse-
crosslink。我的快速检测片段大小和ChIP DNA浓度的步骤如下，供你参考参考。
Check chromatin size and conc.
1. Dilute 50 ul chromatin extracts with 50 ul TE buffer. Add 4 ul of 5 M
NaCl and 1 ul of 10 mg/ml Proteinase K (Invitrogen #25530-015) (use a PCR
tube).
2. Incubate at 65 oC for at lease 4 hr (using a PCR machine) to reverse
crosslink.
3. Add 2 ul of 10 mg/ml RNase A (Sigma #R6513), incubate at 37 oC for
30min- 1hr.
4. Purify DNA using Qiagen PCR purification column (or phenol/cholorform
purification method). Use 20 ul EB to elute DNA. Measure conc. using
Nanodrop or Invitrogen Qubit™ Fluorometer. Load the rest of DNA into
the 1 % agarose gel. The chromatin should be a smear around 500 bp (using
the loading dye containing only xylene blue).

【在 n******2 的大作中提到】

: Do you sonicate the cells in Lysis buffer?

k*n2012-01-10 08:01

24 楼

你可以试试rick young的protocol的buffer，然后18min做chip－chip足够了，如果你
要做seq，需要再sonicate，保持样品在冰上～

k*n2012-01-10 08:01

25 楼

还有一个，可以考虑稀释一下样品在做sonication，问一下你们sonicate用的什么机器
？

s*s2012-01-10 08:01

26 楼

我们sonicate的buffer里面没有任何detergent，就是plain的Tris EDTA EGTA,
应该是Ren Bing的protocol

0.
detegent
M

【在 j****t 的大作中提到】

: 我是在这个lysis buffer里作sonication的。我现在用0.2% sarkosyl（instead of 0.
: 5%）,和 1% of Na-deoxycholate。sonication的效果很好。而且这个浓度的detegent
: 对于IP 来说还是高了些，我会在做IP前把sample稀释一倍。
: 我觉得你的lysis和sonication 的条件也许可以了，问题说不定是在reverse-
: crosslink。我的快速检测片段大小和ChIP DNA浓度的步骤如下，供你参考参考。
: Check chromatin size and conc.
: 1. Dilute 50 ul chromatin extracts with 50 ul TE buffer. Add 4 ul of 5 M
: NaCl and 1 ul of 10 mg/ml Proteinase K (Invitrogen #25530-015) (use a PCR
: tube).
: 2. Incubate at 65 oC for at lease 4 hr (using a PCR machine) to reverse