cell sorting 问题求助# Biology - 生物学
N*7
1 楼
算是开张了吧，不过仅仅是HR，她说回头给HM汇报一下
问了3年的工资和奖金，没见过问得这样细的
聊以自慰的是，说明自己marketability 还不算太差，由他去吧
问了3年的工资和奖金，没见过问得这样细的
聊以自慰的是，说明自己marketability 还不算太差，由他去吧
l*3
2 楼
郑朴捷律师有谁让他做过？怎么样？
s*n
3 楼
【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: slin (), 信区: Military
标 题: 李bing 宪出来了啊
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Feb 28 23:07:56 2016, 美东)
终于有亚裔了
发信人: slin (), 信区: Military
标 题: 李bing 宪出来了啊
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Feb 28 23:07:56 2016, 美东)
终于有亚裔了
h*G
4 楼
hello,
最近需要用cell surface marker 细胞染色，sort positive 的细胞，然后重新plate
培养。每次sort完细胞，重新plate以后，细胞总是大量死亡。希望大家有什么建议。
下面是我的protocol
Trypsin cells. Stop reaction. collect cells. Wash once with PBS+0.2% BSA.
Staining cells in the dark at RT for 25 min. Staining buffer: PBS (w/o Ca2+
Mg2+) + 0.2% BSA+ 0.09% NaN3.
Wash three twice. (500gX5 min every time)
Resuspend cells in Staining buffer. Sort cells..
Replate positive cells.
最近需要用cell surface marker 细胞染色，sort positive 的细胞，然后重新plate
培养。每次sort完细胞，重新plate以后，细胞总是大量死亡。希望大家有什么建议。
下面是我的protocol
Trypsin cells. Stop reaction. collect cells. Wash once with PBS+0.2% BSA.
Staining cells in the dark at RT for 25 min. Staining buffer: PBS (w/o Ca2+
Mg2+) + 0.2% BSA+ 0.09% NaN3.
Wash three twice. (500gX5 min every time)
Resuspend cells in Staining buffer. Sort cells..
Replate positive cells.
V*n
5 楼
1) 也许和Sorting无关，消化细胞这步就可能导致很高的细胞死亡。消化后重新培养
试试。
2) NaN3这个浓度肯定能杀细胞了
3) Sorting时候染色的抗体也可能诱导细胞死亡
试试。
2) NaN3这个浓度肯定能杀细胞了
3) Sorting时候染色的抗体也可能诱导细胞死亡
f*a
6 楼
1. 0.05% trypson
2. 0.09% NaN3 is toxic. THere is no need to add this while doing live
staining.
3.why do you use 500g? 200g is enough.
4. Wash once instead of 3 times. Live staining usually does not have high
background. Given that the incubation time is 15min on ice. The buffer must
contain 5% NDS
5. Use low pressure while sorting. Use a DAPI or PI to exclude dead cells.
2. 0.09% NaN3 is toxic. THere is no need to add this while doing live
staining.
3.why do you use 500g? 200g is enough.
4. Wash once instead of 3 times. Live staining usually does not have high
background. Given that the incubation time is 15min on ice. The buffer must
contain 5% NDS
5. Use low pressure while sorting. Use a DAPI or PI to exclude dead cells.
O*n
7 楼
do not use your staining buffer with nan3 if you want to sort cells, just
use pbs with 5% fcs or HBSS with 5% fcs; large volume wash once. sort cells
into tube with fcs
plate
Ca2+
【在 h*****G 的大作中提到】
: hello,
: 最近需要用cell surface marker 细胞染色，sort positive 的细胞，然后重新plate
: 培养。每次sort完细胞，重新plate以后，细胞总是大量死亡。希望大家有什么建议。
: 下面是我的protocol
: Trypsin cells. Stop reaction. collect cells. Wash once with PBS+0.2% BSA.
: Staining cells in the dark at RT for 25 min. Staining buffer: PBS (w/o Ca2+
: Mg2+) + 0.2% BSA+ 0.09% NaN3.
: Wash three twice. (500gX5 min every time)
: Resuspend cells in Staining buffer. Sort cells..
: Replate positive cells.
use pbs with 5% fcs or HBSS with 5% fcs; large volume wash once. sort cells
into tube with fcs
plate
Ca2+
【在 h*****G 的大作中提到】
: hello,
: 最近需要用cell surface marker 细胞染色，sort positive 的细胞，然后重新plate
: 培养。每次sort完细胞，重新plate以后，细胞总是大量死亡。希望大家有什么建议。
: 下面是我的protocol
: Trypsin cells. Stop reaction. collect cells. Wash once with PBS+0.2% BSA.
: Staining cells in the dark at RT for 25 min. Staining buffer: PBS (w/o Ca2+
: Mg2+) + 0.2% BSA+ 0.09% NaN3.
: Wash three twice. (500gX5 min every time)
: Resuspend cells in Staining buffer. Sort cells..
: Replate positive cells.
h*G
8 楼
谢谢大家的回复和帮助。
1。关于NaN3,我看了资料，说是可以抑制细胞的代谢，这样可以减少细胞死亡以及cell
surface marker的endocytosis. 那NaN3具体的作用是什么，以及什么时候已经使用呢？
2。关于5%的FCS. 有些地方是用0.2%的 BSA. 这两个有什么去区别吗？ 谢谢。
1。关于NaN3,我看了资料，说是可以抑制细胞的代谢，这样可以减少细胞死亡以及cell
surface marker的endocytosis. 那NaN3具体的作用是什么，以及什么时候已经使用呢？
2。关于5%的FCS. 有些地方是用0.2%的 BSA. 这两个有什么去区别吗？ 谢谢。
h*G
9 楼
还有，在4C 或者 室温下孵一抗 会有多大的差别？
谢谢。
谢谢。
d*d
10 楼
同意，staining buffer 不加NaN3，提高FBS浓度到5%。
另外，collection tube里面加上0.5-1ml FCS 或者 culture medium，直接把cell
sorting 到里面。
staining和sorting之后很多细胞死亡挺正常的。
另外，collection tube里面加上0.5-1ml FCS 或者 culture medium，直接把cell
sorting 到里面。
staining和sorting之后很多细胞死亡挺正常的。
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