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请教baculovirus transfection

请教baculovirus transfection# Biology - 生物学

e*m2013-03-18 07:03

1 楼

跟imac 27价格差不多甚至更高一点吧，这个有什么特殊之处么？屏幕很高级么？还是
说这个一般都是有deal的时候才买的

A*w2013-03-18 07:03

2 楼

最近在做baculovirus transfection一直做不出来
用了两种不同的方法，一个是BD BaculoGold DNA ＋ pVL1393-DNA.
就是follow manual
另一是Bac to Bac system，用cellfectin II reagent。
用的是Sf-21 conditioned in Sf-900II media （大于95％viability)
怎么做都在5天transfection后看不到病态细胞
然后amplification后也没有～
请大牛指教！
感谢！

X*n2013-03-18 07:03

3 楼

因为xps欢迎摸

n*32013-03-18 07:03

4 楼

是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊？我们做的时候7天以后Sf9 cells
就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。
“amplification后也没有”是什么意思？没有检测到目标蛋白基因的表达？

b*t2013-03-18 07:03

5 楼

Outlet半价

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.2.2

【在 e**********m 的大作中提到】

: 跟imac 27价格差不多甚至更高一点吧，这个有什么特殊之处么？屏幕很高级么？还是
: 说这个一般都是有deal的时候才买的

m*82013-03-18 07:03

6 楼

一般来说这种情况就是BACMID DNA有问题。

【在 A****w 的大作中提到】

: 最近在做baculovirus transfection一直做不出来
: 用了两种不同的方法，一个是BD BaculoGold DNA ＋ pVL1393-DNA.
: 就是follow manual
: 另一是Bac to Bac system，用cellfectin II reagent。
: 用的是Sf-21 conditioned in Sf-900II media （大于95％viability)
: 怎么做都在5天transfection后看不到病态细胞
: 然后amplification后也没有～
: 请大牛指教！
: 感谢！

A*w2013-03-18 07:03

7 楼

BD BaculoGold DNA ＋ pVL1393-DNA 那个没有bacmid prep的这一步
bac to bac BACMID DNA用M13和目标基因的特异引物检测的，可以看到pcr产物，难道
是transfection的量不够，用quick and dirty prep的。
》》是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊？我们做的时候7天以后Sf9
cells
就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。
感觉是没有拿到baculovirus，细胞transfection 5－7天后，看不到涨大的病态细胞（
或者和control差别不大）看不出来。。。
有些时候看到是好多死细胞了，有的时候看起来还行。
》》“amplification后也没有”是什么意思？没有检测到目标蛋白基因的表达？
就是在transfection后，有这个supernatant去infect健康的细胞（在T75里）。然后看
细胞形态，也做蛋白表达检测（western）

T*u2013-03-18 07:03

8 楼

我当时做的时候也是第一代看不明显蛋白也测不到表达。但是我再去扩增第二代就有了。

【在 A****w 的大作中提到】

: BD BaculoGold DNA ＋ pVL1393-DNA 那个没有bacmid prep的这一步
: bac to bac BACMID DNA用M13和目标基因的特异引物检测的，可以看到pcr产物，难道
: 是transfection的量不够，用quick and dirty prep的。
: 》》是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊？我们做的时候7天以后Sf9
: cells
: 就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。
: 感觉是没有拿到baculovirus，细胞transfection 5－7天后，看不到涨大的病态细胞（
: 或者和control差别不大）看不出来。。。
: 有些时候看到是好多死细胞了，有的时候看起来还行。
: 》》“amplification后也没有”是什么意思？没有检测到目标蛋白基因的表达？

B*a2013-03-18 07:03

9 楼

bac to bac
一大早提fresh的bacmid
你加8-10ug 的bacmid DNA （因为bacmid不会很纯）
等72个小时，~2ml 的P1 全用来做一盘子P2

A*w2013-03-18 07:03

10 楼

请问你的bac to bac提取的方法是啥？
是不是我上面提及的quick－and－dirty的方法
还是用kit的啊？

【在 B*****a 的大作中提到】

: bac to bac
: 一大早提fresh的bacmid
: 你加8-10ug 的bacmid DNA （因为bacmid不会很纯）
: 等72个小时，~2ml 的P1 全用来做一盘子P2

B*a2013-03-18 07:03

11 楼

MINIprep buffer I II III, 然后直接异丙醇沉淀，不用column提纯

【在 A****w 的大作中提到】

: 请问你的bac to bac提取的方法是啥？
: 是不是我上面提及的quick－and－dirty的方法
: 还是用kit的啊？

B*a2013-03-18 07:03

12 楼

还有bacmid到P1，这步过了72h,infection不是很明显，但是P1到P2这步>48小时，会比
较明显。
真跟你的bacmid有没有insertion没有关系，全看titer

【在 A****w 的大作中提到】

: 请问你的bac to bac提取的方法是啥？
: 是不是我上面提及的quick－and－dirty的方法
: 还是用kit的啊？

I*y2013-03-18 07:03

13 楼

get the PureLink kit to purify Bacmid

【在 A****w 的大作中提到】

: 请问你的bac to bac提取的方法是啥？
: 是不是我上面提及的quick－and－dirty的方法
: 还是用kit的啊？

S*r2013-03-18 07:03

14 楼

说的没错，bac to bac很有可能P1和P2的细胞形变都不明显。可以像上面某位说的那样
，P1全部用来做P2，做P3的时候多加P2。
P1，P2，P3的细胞都可以直接western，就知道蛋白是否表达。

【在 B*****a 的大作中提到】

: 还有bacmid到P1，这步过了72h,infection不是很明显，但是P1到P2这步>48小时，会比
: 较明显。
: 真跟你的bacmid有没有insertion没有关系，全看titer

b*e2013-03-18 07:03

15 楼

P1看不到很正常
你试试把2ml P1（3-4天）扔进10ml Sf9里,没隔一天查一次cell density
如果cell density加倍了就加midium稀释回2m
这样养4-5天看看，只要cell density不加倍了就说明成功了
另外cellfectin II reagent加多点，bacmid浓度大一些

【在 A****w 的大作中提到】

A*w2013-03-18 07:03

16 楼

好，谢谢各位建议。

x*22013-03-18 07:03

17 楼

http://www.wistar.org/our-science/shared-resources-cores/protei
实在不放心，把bacmid送去让他们transfect，之后送300ml P3给你，300刀一次

b*e2013-03-18 07:03

18 楼

300ml P3 也就infect 15－20L 的cell，这生意不错，呵呵

【在 x**2 的大作中提到】

: http://www.wistar.org/our-science/shared-resources-cores/protei
: 实在不放心，把bacmid送去让他们transfect，之后送300ml P3给你，300刀一次