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1包子求助各位大侠用PCR扩增整个质粒的问题?

1包子求助各位大侠用PCR扩增整个质粒的问题?# Biology - 生物学

b*u2013-05-31 07:05

1 楼

大家都知道，在神探狄仁杰中曾泰是狄仁杰的学生。当然，可不是真的学生。在古代的
礼法中学生不仅仅指的是曾经教授学业的老师，连参加科举考试的主考官都是所有学生
的老师，这些学生如果高中做官后都可以认主考为老师。
是狄仁杰在和曾泰聊到他参加科举考试的时候，发现他是那次的主考官，曾泰借机巴结
狄仁杰认其为师。不能不说，曾泰还是很有灵光劲的，他知道东些歪脑筋。在上面没有
人，在任上做了县令多年没办法的情况下，便投靠了梅花内卫。梅花内卫是属于皇帝武
则天管理的特殊机构，有了这层身份想往上爬，结果内卫太多了，还是没爬成功。
最后和狄仁杰遇到一起之后，他又趁机倒在了狄仁杰这一派。由此一路高升，做到刺史
一级的封疆大吏。但是问题是，作为武则天私人特务和暗杀组织的梅花内卫，难道没有
严格的制度么，像曾泰这样的脱离组织，倒入狄仁杰的官员，武则天难道会不知道么。
怎么还会在狄仁杰的举荐下重用呢。
难道武则天觉得狄仁杰比梅花内卫还要衷心耿耿。

i*l2013-05-31 07:05

2 楼

去年8月底的那批。就是那个speaker旁的边框，裂了半年多了，一直懒得修。现在依稀
记得很多人当时都寄去免费换了外壳。现在还能换吗？电话应该事多少？多谢。

B*w2013-05-31 07:05

3 楼

我有一个质粒6KB左右，用PCR扩增了其中一个1KB的片段，然后用这个1KB的片段作
primer，直接扩增整个质粒，用高保真的酶，就相当于QuikChange，是否可以扩增整个
质粒？

b*82013-05-31 07:05

4 楼

主要是狄仁杰大力推荐曾泰
曾泰虽然智商一般，办事能力一般，但不能否认曾泰有个狄仁杰最看重的优点：忠心耿
耿。只要是狄仁杰吩咐的，曾泰会尽全力去办。一般的大臣，往往憋着要和狄仁杰比智
力，潜意识里往往抵触狄仁杰的命令，不愿做木偶。对狄仁杰而言，找个智商高的跟班
，并不能增加自己的办案能力，因为自己智商已经足够了，而培养个死忠的地方大员，
作用更大。
这一点跟元方不同。李元芳经常独立调查，跟狄仁杰同时操作两条线索。狄仁杰要求李
元芳不仅有武功，还要有过人的智力。

t*g2013-05-31 07:05

5 楼

yes. you can try online chat.

【在 i***l 的大作中提到】

: 去年8月底的那批。就是那个speaker旁的边框，裂了半年多了，一直懒得修。现在依稀
: 记得很多人当时都寄去免费换了外壳。现在还能换吗？电话应该事多少？多谢。

q*72013-05-31 07:05

6 楼

没有问题，用PCR进行点突变就是类似这么干的。是做突变吗？干吗要用１KB做引物？
你可以在希望扩增停止的地方用酶切开，线性化估计会好些。
你可以用这个公司的DNTP，便宜又好用。还有他们提PCR和DNA片段回收的试剂盒（２合
一）。不象QIAGEN的试剂盒回收的DNA片段中混有洗液而影响克隆效率。
http://www.greenbioresearch.com/dntp-sets-dntp-mix/
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification

d*y2013-05-31 07:05

7 楼

俺也拿去修修好了。

B*w2013-05-31 07:05

8 楼

刚刚试了一下！好像不行呀！出来的都是Smear.用的酶是phusion, 94度变性，72度退
火延伸。

m*o2013-05-31 07:05

9 楼

一年之内应该是可以的

j*x2013-05-31 07:05

10 楼

phusion需要99度变性
这酶挺好用的，仔细看说明书吧

【在 B****w 的大作中提到】

: 刚刚试了一下！好像不行呀！出来的都是Smear.用的酶是phusion, 94度变性，72度退
: 火延伸。

i*l2013-05-31 07:05

11 楼

这要拿去全factory reset了，回来重装一遍所有的系统和app，要搞死了。现在hp还是
要reset全部吗？

【在 t*****g 的大作中提到】

: yes. you can try online chat.

q*72013-05-31 07:05

12 楼

建议用３步PCR，另外，应该用PHUSION变性一般用９８C

q*72013-05-31 07:05

13 楼

如果用１KB做引物，我建议你同时再加你５＇端的一般引物，根据你目的，量上要调整
模板等

d*h2013-05-31 07:05

14 楼

不知扩增的目的是什么？
如果是要插入大的片段的话，可以用一对反向无重叠反向primer，一步PCR扩增整个
plasmid。如果是点突变，可以把突变位点加入到这对primer两端。不需要切质粒。
---forward primer
5‘-----------------------------------------------
3’-----------------------------------------------
reverse----

【在 B****w 的大作中提到】

: 我有一个质粒6KB左右，用PCR扩增了其中一个1KB的片段，然后用这个1KB的片段作
: primer，直接扩增整个质粒，用高保真的酶，就相当于QuikChange，是否可以扩增整个
: 质粒？