请教一般如何做的Chimera protein# Biology - 生物学
s*x
1 楼
做分子的经验很少，限于简单clone和点突变。
最近需要把三个蛋白片段连起来，实在没有什么经验，请教板上的大牛一般这种
chimera protein怎么做。
有人建议我用一些多酶切位点的载体例如T vector或者bluescript之类，然后把三个片
段依次找好酶切位点连进去，但是我发现这三个片段可用的酶切位点很有限，而且要in
frame，很不好做；
还有策略是先酶切连接两个片段，可以用同尾酶使产物不再具有被切的危险，然后做
PCR扩增连接产物，然后再连接另外的片段，这个方案感觉快一些，但是不知道应该如
何具体做？酶切后连接后要不要纯化（用quick spin一类的column回收全部片段）？用
多少产物做下一步PCR？这种用连接产物做的PCR是否有需要特别注意的条件？
还有的策略就是用类似传统点突变的方法，先PCR出两个片段，中间有overlap，然后用
两头的primer把两个片段连接的片段P出来，不知道一般这种overlap的区域有多大？
PCR有何需要注意的？
不知道大家一般怎么做这种chimera，几种策略有何优缺点，恳请指教。万分感谢！
最近需要把三个蛋白片段连起来，实在没有什么经验，请教板上的大牛一般这种
chimera protein怎么做。
有人建议我用一些多酶切位点的载体例如T vector或者bluescript之类，然后把三个片
段依次找好酶切位点连进去，但是我发现这三个片段可用的酶切位点很有限，而且要in
frame，很不好做；
还有策略是先酶切连接两个片段，可以用同尾酶使产物不再具有被切的危险，然后做
PCR扩增连接产物，然后再连接另外的片段，这个方案感觉快一些，但是不知道应该如
何具体做？酶切后连接后要不要纯化（用quick spin一类的column回收全部片段）？用
多少产物做下一步PCR？这种用连接产物做的PCR是否有需要特别注意的条件？
还有的策略就是用类似传统点突变的方法，先PCR出两个片段，中间有overlap，然后用
两头的primer把两个片段连接的片段P出来，不知道一般这种overlap的区域有多大？
PCR有何需要注意的？
不知道大家一般怎么做这种chimera，几种策略有何优缺点，恳请指教。万分感谢！
