Should long primers work Okay for regular PCR?# Biology - 生物学
w*u
1 楼
川霸王 夫妻肺片酱
我觉得味道挺正的（非四川人），非常像夫妻肺片的味道
不会熬红油的童鞋们有福了，不用麻烦，就能吃到好吃的夫妻肺片～～～
一小瓶也挺便宜的吧，就1块多钱，大家可以买来试试
我觉得味道挺正的（非四川人），非常像夫妻肺片的味道
不会熬红油的童鞋们有福了，不用麻烦，就能吃到好吃的夫妻肺片～～～
一小瓶也挺便宜的吧，就1块多钱，大家可以买来试试
a*i
2 楼
正在使用ELIS 给父母延期，到了upload 文件的那一步，没法走下去了。browne file
之后，不管点save 还是 add file，那个browze 文件的地方都会变成空白，没法进行
下一步。麻烦谁能不能指点一下？非常非常感谢。
之后，不管点save 还是 add file，那个browze 文件的地方都会变成空白，没法进行
下一步。麻烦谁能不能指点一下？非常非常感谢。
S*E
3 楼
其实这个才是真正的retina display， 330 ppi，肉眼是没法看出颗粒了。
还有就是这个分辨率稍微大于两个1080p的电视，在宣传上是很好的卖点。
但是这个的总像素比牛排又多1.56倍，电池和显卡压力都很大，恐怕技术上很难。如果
乔布斯在世，说不定有变态方法push工程师实现这个分辨率。
还有就是这个分辨率稍微大于两个1080p的电视，在宣传上是很好的卖点。
但是这个的总像素比牛排又多1.56倍，电池和显卡压力都很大，恐怕技术上很难。如果
乔布斯在世，说不定有变态方法push工程师实现这个分辨率。
x*u
4 楼
I have to design a forward primer consisting of restriction sites (8 base),
operator region (35 base), ribosome biding site (6 base), spacer sequence (
about 20 base) and the priming sequence (21 base) of my target gene. The
total lenth would be 100 base for this forward primer and the reverse primer
is just 30 base. Does anyone know if this primer set would be okay for PCR
amplifying my target gene (around 720bp)?
Thanks a lot.
operator region (35 base), ribosome biding site (6 base), spacer sequence (
about 20 base) and the priming sequence (21 base) of my target gene. The
total lenth would be 100 base for this forward primer and the reverse primer
is just 30 base. Does anyone know if this primer set would be okay for PCR
amplifying my target gene (around 720bp)?
Thanks a lot.
A*a
5 楼
zan 一把!!
【在 w*******u 的大作中提到】
: 川霸王 夫妻肺片酱
: 我觉得味道挺正的（非四川人），非常像夫妻肺片的味道
: 不会熬红油的童鞋们有福了，不用麻烦，就能吃到好吃的夫妻肺片～～～
: 一小瓶也挺便宜的吧，就1块多钱，大家可以买来试试
【在 w*******u 的大作中提到】
: 川霸王 夫妻肺片酱
: 我觉得味道挺正的（非四川人），非常像夫妻肺片的味道
: 不会熬红油的童鞋们有福了，不用麻烦，就能吃到好吃的夫妻肺片～～～
: 一小瓶也挺便宜的吧，就1块多钱，大家可以买来试试
a*i
6 楼
所有file都保存成了PDF格式。
x*a
7 楼
看不出可以拿放大镜看,放大镜也不行就上显微镜.
【在 S***E 的大作中提到】
: 其实这个才是真正的retina display， 330 ppi，肉眼是没法看出颗粒了。
: 还有就是这个分辨率稍微大于两个1080p的电视，在宣传上是很好的卖点。
: 但是这个的总像素比牛排又多1.56倍，电池和显卡压力都很大，恐怕技术上很难。如果
: 乔布斯在世，说不定有变态方法push工程师实现这个分辨率。
【在 S***E 的大作中提到】
: 其实这个才是真正的retina display， 330 ppi，肉眼是没法看出颗粒了。
: 还有就是这个分辨率稍微大于两个1080p的电视，在宣传上是很好的卖点。
: 但是这个的总像素比牛排又多1.56倍，电池和显卡压力都很大，恐怕技术上很难。如果
: 乔布斯在世，说不定有变态方法push工程师实现这个分辨率。
s*y
8 楼
可以做，但是条件得摸索一下。
我做过70+ 20 的组合条件，感觉杂带比较多。不过把正确带切出来再放大一次就好了。
,
primer
PCR
【在 x********u 的大作中提到】
: I have to design a forward primer consisting of restriction sites (8 base),
: operator region (35 base), ribosome biding site (6 base), spacer sequence (
: about 20 base) and the priming sequence (21 base) of my target gene. The
: total lenth would be 100 base for this forward primer and the reverse primer
: is just 30 base. Does anyone know if this primer set would be okay for PCR
: amplifying my target gene (around 720bp)?
: Thanks a lot.
我做过70+ 20 的组合条件，感觉杂带比较多。不过把正确带切出来再放大一次就好了。
,
primer
PCR
【在 x********u 的大作中提到】
: I have to design a forward primer consisting of restriction sites (8 base),
: operator region (35 base), ribosome biding site (6 base), spacer sequence (
: about 20 base) and the priming sequence (21 base) of my target gene. The
: total lenth would be 100 base for this forward primer and the reverse primer
: is just 30 base. Does anyone know if this primer set would be okay for PCR
: amplifying my target gene (around 720bp)?
: Thanks a lot.
y*o
9 楼
+1
【在 A***a 的大作中提到】
: zan 一把!!
【在 A***a 的大作中提到】
: zan 一把!!
l*i
10 楼
我觉得是网站有问题,我到最后一步这照片总上载不了.已经试几次,光显示正在上载,就
是过不去
是过不去
x*u
11 楼
He would push it to the next iPad if they couldn't do it perfectly in this
generation.
【在 S***E 的大作中提到】
: 其实这个才是真正的retina display， 330 ppi，肉眼是没法看出颗粒了。
: 还有就是这个分辨率稍微大于两个1080p的电视，在宣传上是很好的卖点。
: 但是这个的总像素比牛排又多1.56倍，电池和显卡压力都很大，恐怕技术上很难。如果
: 乔布斯在世，说不定有变态方法push工程师实现这个分辨率。
x*u
12 楼
Thanks a lot, Sunnyday LaoShi!
了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 可以做，但是条件得摸索一下。
: 我做过70+ 20 的组合条件，感觉杂带比较多。不过把正确带切出来再放大一次就好了。
:
: ,
: primer
: PCR
了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 可以做，但是条件得摸索一下。
: 我做过70+ 20 的组合条件，感觉杂带比较多。不过把正确带切出来再放大一次就好了。
:
: ,
: primer
: PCR
n*w
13 楼
不会熬红油的谢谢推荐
l*0
14 楼
有包啊
n*w
15 楼
I never tried that long. I only tried 45 as the max.
You can also do overlap PCR so you can use short primer at every time.
You can also do overlap PCR so you can use short primer at every time.
F*t
16 楼
上张PP看看吧
我总在华人超市找夫妻肺片的调料
怎么也找不到
馋了很久了已经
我总在华人超市找夫妻肺片的调料
怎么也找不到
馋了很久了已经
c*n
17 楼
现在我对提高分辨率已经没有兴趣了， 当前的电池技术和gpu还不能达到理想状态。
f*e
18 楼
We found it is hard to get clear and single band using longer primer.
Now we normally design two overlapped PCR primer which each one is less than
50 bp in length.It works very well in my lab.
,
primer
PCR
【在 x********u 的大作中提到】
: I have to design a forward primer consisting of restriction sites (8 base),
: operator region (35 base), ribosome biding site (6 base), spacer sequence (
: about 20 base) and the priming sequence (21 base) of my target gene. The
: total lenth would be 100 base for this forward primer and the reverse primer
: is just 30 base. Does anyone know if this primer set would be okay for PCR
: amplifying my target gene (around 720bp)?
: Thanks a lot.
Now we normally design two overlapped PCR primer which each one is less than
50 bp in length.It works very well in my lab.
,
primer
PCR
【在 x********u 的大作中提到】
: I have to design a forward primer consisting of restriction sites (8 base),
: operator region (35 base), ribosome biding site (6 base), spacer sequence (
: about 20 base) and the priming sequence (21 base) of my target gene. The
: total lenth would be 100 base for this forward primer and the reverse primer
: is just 30 base. Does anyone know if this primer set would be okay for PCR
: amplifying my target gene (around 720bp)?
: Thanks a lot.
w*u
19 楼
我试着google了，可是没找到照片。
我再试下哦，不行的话我就拍一张传上来～
我再试下哦，不行的话我就拍一张传上来～
v*s
20 楼
Jobs在世也不可能，为了保证兼容性，苹果的分辨率都是直接加倍的
如果ipad 1代推出的时候就是1280，那么今天的ipad3就会是2560了
如果ipad 1代推出的时候就是1280，那么今天的ipad3就会是2560了
C*e
21 楼
理论上说应该没有问题
不过可能要摸条件
我用70-80，还有>100的primer做过regular PCR
不过我用的primer
1.Fwd和Rev差不多等长，Tm接近，
而且priming sequence (for target gene)部分的Tm也接近
2.我用的priming sequence比较长，24-28nts
我觉得你做的时候可能
1.不仅reaction的条件要摸
2.PCR cycle的设定要摸（除了gradient，还有touch down，touch up，3 steps, 2
steps之类的可以试）
3.有可能template也要试,我遇到过用整个plasmid不行，
把target gene的fragment切下来胶纯化以后做模板就没有问题
4.如果一切不顺利，建议reverse primer也设计个长点的
哦对了，还有一点，长的那个primer，最好要订纯化过的
不用HPLC纯化的也要PAGE纯化的
或者订了std desalted的回来自己用PAGE胶纯化一下
越长的primer越有可能5'段少一些（对于>100 nts的primer可能少的是一截）
甚至靠近5'段有些deletion,mutation也是可能的
如果不纯化，后面你挑positive clones去测序的时候就该郁闷了
不过可能要摸条件
我用70-80，还有>100的primer做过regular PCR
不过我用的primer
1.Fwd和Rev差不多等长，Tm接近，
而且priming sequence (for target gene)部分的Tm也接近
2.我用的priming sequence比较长，24-28nts
我觉得你做的时候可能
1.不仅reaction的条件要摸
2.PCR cycle的设定要摸（除了gradient，还有touch down，touch up，3 steps, 2
steps之类的可以试）
3.有可能template也要试,我遇到过用整个plasmid不行，
把target gene的fragment切下来胶纯化以后做模板就没有问题
4.如果一切不顺利，建议reverse primer也设计个长点的
哦对了，还有一点，长的那个primer，最好要订纯化过的
不用HPLC纯化的也要PAGE纯化的
或者订了std desalted的回来自己用PAGE胶纯化一下
越长的primer越有可能5'段少一些（对于>100 nts的primer可能少的是一截）
甚至靠近5'段有些deletion,mutation也是可能的
如果不纯化，后面你挑positive clones去测序的时候就该郁闷了
F*t
22 楼
谢谢哈
【在 w*******u 的大作中提到】
: 我试着google了，可是没找到照片。
: 我再试下哦，不行的话我就拍一张传上来～
【在 w*******u 的大作中提到】
: 我试着google了，可是没找到照片。
: 我再试下哦，不行的话我就拍一张传上来～
h*t
23 楼
据说散热不好啊
h*e
24 楼
我们经常做red重组 引物一般都70-100bp
没问题
如果是以质粒为模板 基本没杂带
要是一复杂的genomic DNA为模板 就不太好弄
没问题
如果是以质粒为模板 基本没杂带
要是一复杂的genomic DNA为模板 就不太好弄
j*u
25 楼
我不喜欢川霸王的火锅料，因为即使夏天，油都是硬的。说明油不是一般的植物油，而
是不好的棕榈油或者什么油。因为不饱和氢键都饱和了，才会变硬。提醒大家，慎吃
是不好的棕榈油或者什么油。因为不饱和氢键都饱和了，才会变硬。提醒大家，慎吃
p*e
26 楼
that's more pixel than mac 27inch scree, which costs $1000.
27 inch screen has 2456X1440
27 inch screen has 2456X1440
b*n
27 楼
可以分两到三次PCR，毕竟长引物价格贵而且容易合成错误
第一次用RBS+SPACE+Priming sequencing作为forward
得到的产物纯化一下作为第二次PCR的模板
第二次用restriction+operator+RBS+Space作为forward
,
primer
PCR
【在 x********u 的大作中提到】
: I have to design a forward primer consisting of restriction sites (8 base),
: operator region (35 base), ribosome biding site (6 base), spacer sequence (
: about 20 base) and the priming sequence (21 base) of my target gene. The
: total lenth would be 100 base for this forward primer and the reverse primer
: is just 30 base. Does anyone know if this primer set would be okay for PCR
: amplifying my target gene (around 720bp)?
: Thanks a lot.
第一次用RBS+SPACE+Priming sequencing作为forward
得到的产物纯化一下作为第二次PCR的模板
第二次用restriction+operator+RBS+Space作为forward
,
primer
PCR
【在 x********u 的大作中提到】
: I have to design a forward primer consisting of restriction sites (8 base),
: operator region (35 base), ribosome biding site (6 base), spacer sequence (
: about 20 base) and the priming sequence (21 base) of my target gene. The
: total lenth would be 100 base for this forward primer and the reverse primer
: is just 30 base. Does anyone know if this primer set would be okay for PCR
: amplifying my target gene (around 720bp)?
: Thanks a lot.
w*u
28 楼
这个不是火锅料，是酱。上面有一层油，我放冰箱里都还是油状的
川霸王的火锅底料我也不喜欢。我一般买小蒙羊，味道很好，虽然味道不及小肥羊，但
是价格便宜了一半呢
【在 j****u 的大作中提到】
: 我不喜欢川霸王的火锅料，因为即使夏天，油都是硬的。说明油不是一般的植物油，而
: 是不好的棕榈油或者什么油。因为不饱和氢键都饱和了，才会变硬。提醒大家，慎吃
川霸王的火锅底料我也不喜欢。我一般买小蒙羊，味道很好，虽然味道不及小肥羊，但
是价格便宜了一半呢
【在 j****u 的大作中提到】
: 我不喜欢川霸王的火锅料，因为即使夏天，油都是硬的。说明油不是一般的植物油，而
: 是不好的棕榈油或者什么油。因为不饱和氢键都饱和了，才会变硬。提醒大家，慎吃
Z*5
29 楼
没试过。不过不太建议这么做，合成100bp以上的引物应该不便宜吧。
要是我的话，就直接在primer上加上酶切位点和保护碱基，做普通的PCR。另一部分直
接合成两条Oligo退火（参考构建shRNA），然后与酶切后的PCR产物，酶切后的载体一
起去做链接，一次就能搞定。
要是我的话，就直接在primer上加上酶切位点和保护碱基，做普通的PCR。另一部分直
接合成两条Oligo退火（参考构建shRNA），然后与酶切后的PCR产物，酶切后的载体一
起去做链接，一次就能搞定。
q*d
30 楼
没吃过川霸王的锅底
但是正宗的火锅是用的牛油，硬的不奇怪
【在 j****u 的大作中提到】
: 我不喜欢川霸王的火锅料，因为即使夏天，油都是硬的。说明油不是一般的植物油，而
: 是不好的棕榈油或者什么油。因为不饱和氢键都饱和了，才会变硬。提醒大家，慎吃
但是正宗的火锅是用的牛油，硬的不奇怪
【在 j****u 的大作中提到】
: 我不喜欢川霸王的火锅料，因为即使夏天，油都是硬的。说明油不是一般的植物油，而
: 是不好的棕榈油或者什么油。因为不饱和氢键都饱和了，才会变硬。提醒大家，慎吃
j*x
31 楼
如果是我的话就直接序列合成了
d*g
32 楼
LOL～～～～太好了，我去找找～～～～
e*s
33 楼
primer dimers!
你这个100 bp的用Primer dimers最合适了。
定2个50-60左右的primer，15bp 左右的overlapping区域，先overlapping PCR做成100
bp左右的primer.
,
primer
PCR
【在 x********u 的大作中提到】
: I have to design a forward primer consisting of restriction sites (8 base),
: operator region (35 base), ribosome biding site (6 base), spacer sequence (
: about 20 base) and the priming sequence (21 base) of my target gene. The
: total lenth would be 100 base for this forward primer and the reverse primer
: is just 30 base. Does anyone know if this primer set would be okay for PCR
: amplifying my target gene (around 720bp)?
: Thanks a lot.
你这个100 bp的用Primer dimers最合适了。
定2个50-60左右的primer，15bp 左右的overlapping区域，先overlapping PCR做成100
bp左右的primer.
,
primer
PCR
【在 x********u 的大作中提到】
: I have to design a forward primer consisting of restriction sites (8 base),
: operator region (35 base), ribosome biding site (6 base), spacer sequence (
: about 20 base) and the priming sequence (21 base) of my target gene. The
: total lenth would be 100 base for this forward primer and the reverse primer
: is just 30 base. Does anyone know if this primer set would be okay for PCR
: amplifying my target gene (around 720bp)?
: Thanks a lot.
s*i
34 楼
赞
我们这的小店没进这个酱
我们这的小店没进这个酱
x*u
35 楼
Thanks for all your suggestions.
I will try overlap PCR first and see what I can get.
I will try overlap PCR first and see what I can get.
D*A
36 楼
可以，我用过75bp的，直接SITE DIRECTED MUTAGENESIS，插入5个MUTATION.
a*y
37 楼
PCR should work but your primers will be expensive enough that you'd better
to get the gene chemically synthesized. 720 bp = 300 USD?
to get the gene chemically synthesized. 720 bp = 300 USD?
D*A
38 楼
720bp只要300块，真便宜
X*n
39 楼
做过120bp的primers，没啥问题。但是价格很贵，360刀一对。
s*8
40 楼
没看懂这个，是把两个短的primer用PCR合成一个长的primer，再用这个长primer去做
PCR吗？
100
【在 e****s 的大作中提到】
: primer dimers!
: 你这个100 bp的用Primer dimers最合适了。
: 定2个50-60左右的primer，15bp 左右的overlapping区域，先overlapping PCR做成100
: bp左右的primer.
:
: ,
: primer
: PCR
PCR吗？
100
【在 e****s 的大作中提到】
: primer dimers!
: 你这个100 bp的用Primer dimers最合适了。
: 定2个50-60左右的primer，15bp 左右的overlapping区域，先overlapping PCR做成100
: bp左右的primer.
:
: ,
: primer
: PCR
d*i
41 楼
早些时候做突变用过78个的还是87个的忘了。。。
W*7
42 楼
我做过100多+20多的，直接就出来，没什么问题，做生物实验要看运气啦！
就想艳阳天MM说的生物这个鬼东西，一切皆有可能！
即使出不来，自己多摸索一下吧，我个人认为摸索过程中的经验是最重要的。
高手之所以能成为高手都是踩着失败一路爬上来的。
版上的高手我敢说绝大部分都是摸索出来，不是别人教出来！
不信你问问艳阳天mm.......呵呵。。。。
就想艳阳天MM说的生物这个鬼东西，一切皆有可能！
即使出不来，自己多摸索一下吧，我个人认为摸索过程中的经验是最重要的。
高手之所以能成为高手都是踩着失败一路爬上来的。
版上的高手我敢说绝大部分都是摸索出来，不是别人教出来！
不信你问问艳阳天mm.......呵呵。。。。
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