作cryo-EM的难度相当于蛋白结晶,一般要耗3-6月摸索条件。快速冰冻来防止冰晶
的形成,在偶然条件下形成单分子冰层(保持液相的特征)。需要有液氮holder
的电镜,和空气湿度的严格要求来确保图像质量。要达到高分辨率,要收集足够的图像
,是个体力活。目前的软件水平也参差不齐,pick particle基本靠手,
几万个particle,坑爹啊。目前cryoEM最成功的就是病毒颗粒的结构,
因为它高度对称,可以大幅缩小到达高分辨率的图像数,所以才有所谓几个A的分辨率
出现。
Negative stain相对要简单很多,对电镜要求也少一些。上手快,成功率高,只要蛋白
不聚集,找到合适的浓度把蛋白分子颗粒均匀分布在grid上,stain合适,图
像对比度会比cryoEM清晰很多。但因为有重金属铀的覆盖,解出来的结构分辨率
就上不去了。
最牛的是2D-结晶,用电镜作x-ray衍射和数据收集,用晶体学的运算解出二维
晶体的结构。不过目前只有水通道这一个成功的例子。