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哪位同学给介绍几篇用CRISPR做screening的文章
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哪位同学给介绍几篇用CRISPR做screening的文章# Biology - 生物学
l*e
1
我现在在做一个抑癌基因,想在基因组的范围内筛选和这个抑癌基因的genetic
interaction.
我知道有CRISPR的library,但没有实际经验,所以想找几篇相关文章看看
或者谁有实际经验传授一下也很感谢。
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H*N
2
为什么不是自己去查而是让别人告诉你?
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m*g
3
Saturation editing of genomic regions by multiplex homology-directed repair?
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C*h
4
相关的paper好多篇
自己搜索一下就能发现。
经验还是很重要的。
早期的library把Cas9和gRNA放在一个载体上,导致病毒滴度太低。
所以最好用新的library.

【在 l*******e 的大作中提到】
: 我现在在做一个抑癌基因,想在基因组的范围内筛选和这个抑癌基因的genetic
: interaction.
: 我知道有CRISPR的library,但没有实际经验,所以想找几篇相关文章看看
: 或者谁有实际经验传授一下也很感谢。

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D*a
5
很多文章不是业内的也不一定知道到底靠谱不靠谱啊。再说了都是发CNS的或者没发CNS
的经典程度也不一样啊。
做过几个课题都应该有这个认识吧,pubmed当然是都在那儿摆着,但是有人带没人带,
入门的快慢不一样。

【在 H****N 的大作中提到】
: 为什么不是自己去查而是让别人告诉你?
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V*t
6
同求问。我正在做screen,原来是用Haploid 细胞+piggyback 做forward genetic
screen
现在也打算用CRISPR。求科普+八卦

【在 l*******e 的大作中提到】
: 我现在在做一个抑癌基因,想在基因组的范围内筛选和这个抑癌基因的genetic
: interaction.
: 我知道有CRISPR的library,但没有实际经验,所以想找几篇相关文章看看
: 或者谁有实际经验传授一下也很感谢。

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d*u
7
哺乳动物细胞里做genome wide crisper screen的就那么几篇吧,都在大牛杂志上呢。
至于Cas9和sgRNA是不是在一个载体上,根据我们的经验,目前最好用的是Zhang Feng
lab的version 2 all in one vector。
有几个实验室载体分开的,必然会有某一个载体的滴度特别低。过这个情况也因为细胞
的不同而异,我们用的是原代细胞,不见得有普遍性。
不过我完全不能理解为什么CRISPR要分成两个载体然后再搞一个inducible system。
从screen的角度来讲,crispr library的数据明显要比shRNA library的数据信噪比高.
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V*t
8
那个nature biotechnology文章
我就是按照他的方法的library和cas9细胞
你说说看法吧

Feng
高.

【在 d****u 的大作中提到】
: 哺乳动物细胞里做genome wide crisper screen的就那么几篇吧,都在大牛杂志上呢。
: 至于Cas9和sgRNA是不是在一个载体上,根据我们的经验,目前最好用的是Zhang Feng
: lab的version 2 all in one vector。
: 有几个实验室载体分开的,必然会有某一个载体的滴度特别低。过这个情况也因为细胞
: 的不同而异,我们用的是原代细胞,不见得有普遍性。
: 不过我完全不能理解为什么CRISPR要分成两个载体然后再搞一个inducible system。
: 从screen的角度来讲,crispr library的数据明显要比shRNA library的数据信噪比高.

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d*u
9
有几篇呢,我不是很确定你具体指的哪一篇。我是按照Zhang lab那片science paper来
的。但是具体的protocol做了一些改变。那个时候他们的vector还是version 1. 病毒
的滴度在我们的细胞里还行,但是加多了会非特异性的杀细胞,所以感染的时候一定要
把MOI控制在比较低的水平。后来他们的version 2出来了,号称滴度增加10倍,但是在
我们的细胞里没看出有这么大的改善,但是在高MOI的时候对细胞的伤害不是那么大了
。从总体screen的质量来看,他们的library表现还是相当好的。

【在 V******t 的大作中提到】
: 那个nature biotechnology文章
: 我就是按照他的方法的library和cas9细胞
: 你说说看法吧
:
: Feng
: 高.

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V*t
10
http://www.nature.com/nbt/journal/v32/n3/full/nbt.2800.html
这个。
为何分开质粒会滴度低?
我想在mESC里面筛选,这篇文正好用mESC,所以选它了。
你说的信噪比,是说什么情况?
请再展开说点什么吧。

【在 d****u 的大作中提到】
: 有几篇呢,我不是很确定你具体指的哪一篇。我是按照Zhang lab那片science paper来
: 的。但是具体的protocol做了一些改变。那个时候他们的vector还是version 1. 病毒
: 的滴度在我们的细胞里还行,但是加多了会非特异性的杀细胞,所以感染的时候一定要
: 把MOI控制在比较低的水平。后来他们的version 2出来了,号称滴度增加10倍,但是在
: 我们的细胞里没看出有这么大的改善,但是在高MOI的时候对细胞的伤害不是那么大了
: 。从总体screen的质量来看,他们的library表现还是相当好的。

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d*u
11
这个为什么载体分开滴度会低我们也不清楚。我们只是把几个主要实验室的载体要过来
在我们的系统里测试得到这样的结果。就像我上面说的,因为我们是用原代细胞,所以
可能没什么代表性。我们能下的结论就是Zhang lab的文库可以提供令人满意的滴度。
而随后的测序也证明的他们的文库里不同gRNA的distribution(也就是说平均每个gRNA
在文库里的丰度)也比较令人满意。你说的这个实验室的文库我们没有试过,我的建议
是最好对比两到三个不同的系统,然后决定用哪一个。
关于信噪比,在这里主要是指假阳性和真阳性的比例。因为在目前绝大多数的基因组级
别的筛选中,假阳性是一个没法回避的结果。虽然有很多方法可以减弱假阳性出现的概
率,但是基本没有可能完全消灭。那么在实验最开始的阶段,文库本身质量的优劣就从
一定程度上决定了你最后筛选结果的信噪比。举个例子说,如果你有两个文库中,第一
个文库中每一个gRNA都是均匀分布的,如果有80000个gRNA,每一个都有10000个copy在
你的文库里(现实中不可能实现),而第二个文库也有80000个gRNA,但是有10%到20%
的gRNA只有少于100个copy,而同样比例的gRNA有超过10000个copy。那么前一个文库的
质量要远好于第二个,筛选产生的信噪比就要高,剔除假阳性的几率也要大很多。这是
从文库的角度分析。
那么在筛选结束后的数据分析也可以帮助降低噪音,但是不管采用什么方法,都是以实
验结果为依据的,那么如果实验结果本身很混乱,数据分析不见得能帮上多大的忙。
另一个提高提高信号的方法,是在相同类型不同来源的细胞株同时进行筛选,然后对数
据进行对比。有点像现在常见的拿好几百个病人样本进行测序然后分析突变一样。这样
能够帮助排除很大一部分假阳性。但是同样也需要高质量的文库和严格控制的筛选流程
一点个人看法,希望对你有所帮助。

【在 V******t 的大作中提到】
: http://www.nature.com/nbt/journal/v32/n3/full/nbt.2800.html
: 这个。
: 为何分开质粒会滴度低?
: 我想在mESC里面筛选,这篇文正好用mESC,所以选它了。
: 你说的信噪比,是说什么情况?
: 请再展开说点什么吧。

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V*t
12
多谢你的信息!非常有用!

gRNA

【在 d****u 的大作中提到】
: 这个为什么载体分开滴度会低我们也不清楚。我们只是把几个主要实验室的载体要过来
: 在我们的系统里测试得到这样的结果。就像我上面说的,因为我们是用原代细胞,所以
: 可能没什么代表性。我们能下的结论就是Zhang lab的文库可以提供令人满意的滴度。
: 而随后的测序也证明的他们的文库里不同gRNA的distribution(也就是说平均每个gRNA
: 在文库里的丰度)也比较令人满意。你说的这个实验室的文库我们没有试过,我的建议
: 是最好对比两到三个不同的系统,然后决定用哪一个。
: 关于信噪比,在这里主要是指假阳性和真阳性的比例。因为在目前绝大多数的基因组级
: 别的筛选中,假阳性是一个没法回避的结果。虽然有很多方法可以减弱假阳性出现的概
: 率,但是基本没有可能完全消灭。那么在实验最开始的阶段,文库本身质量的优劣就从
: 一定程度上决定了你最后筛选结果的信噪比。举个例子说,如果你有两个文库中,第一

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s*i
13
请问为什么不先建立一个Cas9的stable cell line,再转sgRNA library呢?
Cas9本身比较大,包装病毒的滴度会比较低

Feng
高.

【在 d****u 的大作中提到】
: 哺乳动物细胞里做genome wide crisper screen的就那么几篇吧,都在大牛杂志上呢。
: 至于Cas9和sgRNA是不是在一个载体上,根据我们的经验,目前最好用的是Zhang Feng
: lab的version 2 all in one vector。
: 有几个实验室载体分开的,必然会有某一个载体的滴度特别低。过这个情况也因为细胞
: 的不同而异,我们用的是原代细胞,不见得有普遍性。
: 不过我完全不能理解为什么CRISPR要分成两个载体然后再搞一个inducible system。
: 从screen的角度来讲,crispr library的数据明显要比shRNA library的数据信噪比高.

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d*u
14
我们目前的经验是all in one vector和separate vector的滴度差别并没有那么显著(
这个经验是4个月前的,现在有可能有更好的)。而且因为我们用的是primary cell,
本身就不像cell line那样可以传很多很多代。我们用的那个single cas9 vector滴度
又特别低(现在可能有更好的)。光把细胞养起来就好几个passage过去了。 在这种情
况下,all in one vector对我们来说更合适。

【在 s*****i 的大作中提到】
: 请问为什么不先建立一个Cas9的stable cell line,再转sgRNA library呢?
: Cas9本身比较大,包装病毒的滴度会比较低
:
: Feng
: 高.

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s*1
15
能告诉我你用的那个separate vector的质粒名称吗? the one for sgRNA and the
other one for cas9.
谢谢

【在 d****u 的大作中提到】
: 我们目前的经验是all in one vector和separate vector的滴度差别并没有那么显著(
: 这个经验是4个月前的,现在有可能有更好的)。而且因为我们用的是primary cell,
: 本身就不像cell line那样可以传很多很多代。我们用的那个single cas9 vector滴度
: 又特别低(现在可能有更好的)。光把细胞养起来就好几个passage过去了。 在这种情
: 况下,all in one vector对我们来说更合适。

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d*u
16
我们试的是Sabatini & Landers group的inducible system。质粒的名字实在记不住了
,因为我们要质粒的时候还挺早的,那时候这些实验室自己的编号和后来他们放在
addgene上的编号不太一样。你去addgene上找landers lab的质粒就很容易能找到。不
过我们用下来觉得第一,他们cas9的质粒做成病毒后滴度太低,第二,这个质粒泄漏的
比较厉害,虽然号称是可诱导的,但是用flag染色还是能看见不少阳性的细胞。

【在 s*******1 的大作中提到】
: 能告诉我你用的那个separate vector的质粒名称吗? the one for sgRNA and the
: other one for cas9.
: 谢谢

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V*t
17
没错,我就是建立一个cas9 inducible 的stable cell line
然后sgRNA library

【在 s*****i 的大作中提到】
: 请问为什么不先建立一个Cas9的stable cell line,再转sgRNA library呢?
: Cas9本身比较大,包装病毒的滴度会比较低
:
: Feng
: 高.

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s*1
18
在感染细胞时,dual vector system需要两个病毒插入基因组,这样一来,其造成的损
伤是不是要比single vector大
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d*u
19
这个接下来细胞就要接受严峻的双链断裂的考验了,前边这点应该不算啥。呵呵,开玩
笑的!这个实在是因细胞不同而不同。有些细胞就是皮实,怎么转也没关系。有些细胞
就是不行,一点点病毒加进去就挂了。

【在 s*******1 的大作中提到】
: 在感染细胞时,dual vector system需要两个病毒插入基因组,这样一来,其造成的损
: 伤是不是要比single vector大

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l*e
20
感谢热心回复的同学!
我这些天忙没有及时回帖。
我在多做些研究,多讨论讨论,从有经验的人那里拿到的信息比pubmed有用多了,我的
经验。
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V*t
21
我刚收到addgene上买来的feng zhang的library
以后基于细胞的screen就是个常规实验了。很多基因很快就要被一网打尽了
要是这些screen都能自动化就好了 可惜没人愿意把生物实验室自动化、标准化啊

【在 l*******e 的大作中提到】
: 感谢热心回复的同学!
: 我这些天忙没有及时回帖。
: 我在多做些研究,多讨论讨论,从有经验的人那里拿到的信息比pubmed有用多了,我的
: 经验。

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r*z
22
CRISPR QQ 群 308680140
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z*u
23
真的假的?咋个搜到一个啥 梦的初始点 群

【在 r***z 的大作中提到】
: CRISPR QQ 群 308680140
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r*z
24
308680130 sorry
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g*g
25
mark
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l*x
26
zan

【在 z****u 的大作中提到】
: 真的假的?咋个搜到一个啥 梦的初始点 群
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