广东省科学院微生物研究所叶伟研究团队Bioresource Technol | 深海真菌埃德菌胶霉毒素生物合成转录调控机制解析

胶霉毒素是一种由真菌产生的具有广谱抑菌、抑病毒、强抗肿瘤活性和免疫调节活性的毒素。胶霉毒素能抑制肿瘤细胞增殖和病毒RNA复制，并诱发肝星状细胞的凋亡并阻遏转录因子NF-kB的表达，在抗肿瘤、抗病毒和抗肝纤维化、器官移植及免疫抑制剂药物研究领域具有良好的开发前景。胶霉毒素衍生物可制备成杀菌剂和杀虫剂防治植物病害，尤其对防治水稻纹枯病、稻瘟病和稻曲病有很好的防治效果。国外已经将其开发成GL-21、Glio GardTM和Soil GardTM等制剂来防治温室和大田作物的幼苗病害和根部病害，效果非常显著。目前胶霉毒素由于其化学结构复杂、产量不够高等原因导致其在市场上存在较大的缺口。因此解析胶霉毒素生物合成机制提高其产量并获得其新型衍生物能促进胶霉毒素的广泛应用。

在此基础上，广东省科学院微生物研究所叶伟研究员团队前期从深海真菌Dichotomyces cejpii FS110中发现了25个胶霉毒素类化合物，其中18个为新化合物，包括罕见的胶霉毒素二聚体结构(Fan et al., 2016, Liu et al., 2019)。该团队进一步对D. cejpii FS110进行了基因组测序，通过antiSMASH预测了胶霉毒素类化合物的生物合成基因簇gli，并采用体外Cas9核酸酶切割基因组的方式获得了该gli基因簇，并将其插入表达载体，同时鉴定了部分胶霉毒素类化合物生物合成基因的体外生化功能(Ye et al., 2018)。在此基础上，获得了新型胶霉毒素转录调控因子DcGiZ。该团队对该DcGliZ转录调控因子进行表达纯化，并采用凝胶阻滞实验(EMSA)分析了DcGliZ蛋白与生物素标记的胶霉毒素生物合成基因启动子相互作用，结果证实DcGliZ与pG、pM、pN启动子存在相互作用，并进一步通过生物大分子相互作用仪对三者的相互作用力进行了定量分析(Huang et al., 2020)。发现DcGliZ与pN启动子的亲和力最强。但其体内转录调控机制需要进一步验证。CRISPR/Cas9系统是一种利用和guide RNA靶向目标基因并Cas9核酸酶进行剪切从而阻断目标基因表达的基因编辑技术，具有构建简单，效率高，脱靶效率低等优点，该团队前期通过构建适用于D. cejpii的sgRNA表达盒从而实现对该真菌中目标基因的敲除。

▲图1 适用于D. cejpii FS110的CRISPR/Cas9基因敲除系统

该团队进一步采用CRISPR/Cas9系统对DcGliZ进行敲除，发现gliZ基因敲除能阻断D. cejpii FS110中胶霉毒素的生物合成，同时gliZ转录调控因子敲除后gliG、gliM和gliN的表达水平显著下调，其他基因表达水平无显著差异；进一步对DcGliZ进行过表达，发现能显著提升gliG、gliM和gliN的表达水平，同时D. cejpii FS110胶霉毒素的产量提升了16.38 ± 1.36倍，从而提供了一种有效的提升胶霉毒素类化合物产量的合成生物学策略。为了进一步验证DcGliZ结合的启动子序列，本团队采用生物素对pG启动子进行标记，并与DcGliZ蛋白共同孵育，采用Dnase I进行酶切，通过foot printing 及SRR测序确定了DcGliZ结合的启动子序列，从而解析了D. cejpii FS110中DcGliZ的转录调控机制。

为了进一步验证其中gliG、gliM和gliN基因的功能。本团队采用CRISPR/Cas9系统对gliG基因进行了敲除，从而导致胶霉毒素的缺失。同时采用CRISPR/dCas9系统进行转录激活，提升了gliG的表达水平，同时gliZ表达水平也有所提升。此外胶霉毒素及胶霉毒素类似物产量也显著提升，此外，本团队前期通过体外生化实验验证了GliG蛋白的体外生化功能。从而证实了gliG在胶霉毒素生物合成过程中的关键作用。同时，本项目还对gliN和gliM这两个甲基转移酶进行了敲除和过表达。结果表明，gliN的基因敲除能阻断胶霉毒素和甲基胶霉毒素的生物合成，gliM敲除后仍有少量甲基胶霉毒素存在，但D. cejpii FS110中胶霉毒素的产量提升了18.98± 1.28倍。说明gliM敲除能通过减少甲基胶霉毒素的产量从而提升胶霉毒素的产量。gliN的过表达能使胶霉毒素的产量提升8.80±0.35倍。进一步将DcGliN在大肠杆菌中进行表达纯化，并以胶霉毒素为底物进行体外生化反应，结果检测到大量O-甲基胶霉毒素，且胶霉毒素含量明显减少，从而进一步证实DcGliN的N-甲基转移酶和O-甲基转移酶的双重功能。综上所述，本团队阐明了胶霉毒素类化合物的生物合成及转录调控机制，同时为胶霉毒素的大规模生产应用提供了有效的合成生物学策略。

▲图2 D. cejpii FS110中胶霉毒素类化合物生物合成及转录调控机制解析