二阳来袭! 最新Nature综述《新冠药物设计》

SARS-CoV-2刺突是病毒粒子表面的一种同源三聚体I类融合糖蛋白，是病毒侵入所必需的，使其成为了一个有吸引力的抗病毒靶点。在大多数情况下，刺突蛋白被宿主蛋白酶切割成受体结合亚基S1和膜融合亚基S2，被N -链和O-链聚糖严重屏蔽。经过主要的构象重排后，SARS-CoV-2刺突的受体结合域（RBD）与细胞表面的血管紧张素转换酶2（ACE2）具有高亲和力，几乎是SARS-CoV刺突对ACE2的亲和力的22倍。随后的结构转变和蛋白水解裂解驱动三螺旋束的融合后构象，使病毒膜与宿主质膜融合。已经开发了几种类型的药物来抑制刺突-ACE2相互作用或膜融合，包括中和抗体，小分子抑制剂和肽抑制剂。

市场上有100多种单克隆抗体（mAb）用于治疗人类疾病，包括一些用于病毒感染的单克隆抗体，如用于呼吸道合胞病毒的帕利珠单抗和用于埃博拉病毒的安苏威单抗。到目前为止，少数抗SARS-CoV-2单克隆抗体和单克隆抗体混合物已获得批准或授予紧急使用授权（EUA），包括贝特洛维单抗、索特罗维单抗、瑞丹维单抗、巴姆拉尼单抗加依替维单抗、西加维单抗加替沙吉单抗、卡西利单抗加伊地维单抗和阿莫珠单抗加罗鲁塞维单抗（表1）。大多数单克隆抗体和单克隆抗体混合物已被授权作为早期治疗选择，用于治疗轻度至中度COVID-19门诊患者。随着SARS-CoV-2变异株的不断出现，不再推荐使用大多数单克隆抗体（框1），需要继续评估其疗效。

已报告了300多种抗SARS-CoV-2单克隆抗体，包括20多种临床试验候选抗体（补充表2）。这些候选药物主要是通过筛选暴露于SARS-CoV-2的恢复期患者或人源化小鼠的记忆B细胞中的抗体来鉴定的(图3a)。有效的野生型单克隆抗体随后可以在片段结晶区(Fc)进行氨基酸修饰，以开发具有更长的半衰期和增强的效应功能的单克隆抗体。常见的片段结晶区修饰包括：L234A+L235A的LALA 修饰；M252Y+S254T+T256E的YTE修饰；M428L+N434S的LS修饰；L234F+L235E+P331S的TM修饰；以及G236A+A330L+I332E的GAALIE修饰（图3b）。例如，COV2-2130和COV2-2196是两种协同的IgG1κ单克隆抗体，采用YTE修饰（延长半衰期）和TM修饰（降低Fc效应功能），开发了西加维单抗和替沙吉维单抗。尽管所有已上市的抗SARS-CoV-2抗体都是IgG1单克隆抗体（补充表2），但人们对开发SAB-185和XAV-19等多克隆抗体，VHH-E、Nb12和XG014等纳米抗体以及恩索维贝普等生物合成蛋白的兴趣也越来越大（补充表2）。最后，作为抗SARS-CoV-2多克隆抗体的天然来源，来自COVID-19幸存者的高效价恢复期血浆可能提供被动免疫疗法。然而，目前的证据并不普遍支持恢复期血浆在COVID-19标准治疗中的疗效，其广泛使用也带来了重大挑战，包括供应有限、行政和后勤障碍以及SARS-CoV-2感染的抗体依赖性增强。

图 3: 抗刺突单克隆抗体的研制

a，单克隆抗体（mAb）的筛选。从暴露于严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)的恢复期供体或人源化小鼠中收集外周血单个核细胞(PBMCs)。单细胞培养的血浆或记忆B细胞准备筛选有效的单克隆抗体。

b，片段结晶（Fc）-修饰单克隆抗体Fc结构域氨基酸的工程方法，以提高半衰期并降低效应函数。常见的修饰如LALA、TM、LS、YTE和GAALIE，其野生型残基利用人类IgG1 Fc (PDB: 4X4M)的结构可视化，其在选定单克隆抗体中的应用如下图所示。

c，单抗与预融合尖峰三聚体配合物的结构。Bamlanivimab（PDB：7KMG）阻断血管紧张素转换酶2（ACE2）与刺突受体结合域（RBD）（PDB：6M17）的结合。

d，根据它们与刺突RBD的相互作用，可以定义四类抗体。图中显示了每类的代表性抗体，包括阿莫巴维单抗（1类，PDB：7CDI），bamlanivimab（2类，PDB：7KMG），S309（3类，PDB：7TNO）和CR3022（4类，PDB：6W41）。

e，来自多个类别的抗体可以联合抑制SARS-CoV-2变体。SARS-CoV-2变异株在RBD中含有氨基酸替换（如，奥密克戎变异株中的15个突变），这可能会阻碍抗体效力。世卫组织提供的最早记录样本的时间线（见相关链接）显示，病毒从SARS-CoV-2原始毒株进化到如今的十多个变种，包括阿尔法（B.1.1.7）、贝塔（B.1.351）、伽马（P.1）、德尔塔（B.1.617.2）、厄普西隆（B.1.427/B.1.429）、泽塔（第2页）、埃塔（B.1.525）、θ（第3页）、艾奥塔（B.1.526）、卡帕（B.1.617.1）、拉姆达（C.37）、穆（B.1.621）和奥密克戎（B.1.1.529）。来自1类的Omi-18、来自2类的Omi-31和来自4类的纳米抗体C1的三抗体组合可以同时靶向奥密克戎变异株（PDB：7ZFB）的一个RBD。Fab，片段抗原结合。

抗刺突抗体通过两种主要机制减轻SARS-CoV-2感染。一种是病原体中和，其中与刺突结合的抗体，特别是与RBD 结合的抗体，阻止病毒进入。在COVID-19恢复期血浆中，rbd结合抗体约占中和抗体滴度的90%。另一种机制是抗体效应功能，其中抗体通过调理途径、补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞吞噬作用和细胞毒性介导 SARS-CoV-2 病毒粒子或感染细胞的破坏。迄今为止开发的抗体主要靶向RBD以阻断刺突-ACE2相互作用（图 3c），除了少数药物如COV2- 3434、S3H3和4A8靶向刺突RBD外的表位（补充表2）。RBD结合抗体根据其靶向的表位可分为四类（图 3d）。针对非重叠表位的来自不同类别的中和抗体可能组合成混合物，以提高对SARS-CoV-2变体的效力(图3e)。依替维单抗（1类）加巴姆拉尼单抗（2类）和卡西利单抗（1类）加伊德维单抗（3类）等抗体混合物已经上市。

出于多种原因，开发针对SARS-CoV-2变体和多种不同沙贝病毒的广泛中和抗体仍然具有挑战性。首先，SARS-CoV-2刺突蛋白具有高度可变性，能够出现耐药突变。大多数现有的抗刺突抗体对值得关注的奥密克戎变异株（如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.4和BA.5）的活性或无活性，其刺突包含>30个氨基酸取代，其中至少15个位于RBD中（图  3e）。为了对抗中和逃逸，重要的是开发针对刺突RBD内外高度保守的非重叠表位的强效抗体及其组合。其次，基于抗体的疗法可能会为某些疾病早期患者或无法检测到抗sars - cov -2抗体的患者提供临床益处，但对于已经产生内源性抗体反应的住院患者来说，益处可能有限。例如，巴姆拉尼单抗（LY-CoV555）由于对COVID-19住院患者的益处有限而过早退出了ACTIV-3试验（NCT04501978）。抗体疗法是否对治疗重症COVID-19有益仍在研究中。第三，抗SARS-CoV-2抗体的血清滴度随时间推移而降低，RBD靶向抗体可能仅保护几个月。广泛中和超级抗体和通过脂质纳米颗粒包封的mRNA编码的抗体可能具有提供长期保护的潜力。最后，需要静脉或肌肉内输注中和抗体，其严格的储存和分配要求以及高昂的生产成本是限制生活在医疗设施差的资源有限地区的患者获得中和抗体的重要因素。

已经对氯法齐明等可能抑制SARS-CoV-2峰值的小分子进行了研究（补充表1），但到目前为止，尚未报告后期临床试验的结果。与刺突-ACE2相互作用的潜在小分子抑制剂，如MU-UNMC-2、P2119、P2165、H69C2、DRI-C23041和AB-00011778（补充表1），需要进一步优化才能进入临床试验。

姜世勃教授的团队首次报告了几种有效的抗刺突肽抑制剂，这些抑制剂来源于SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV），中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和HIV-1棘突的七重复α-螺旋区。EK1 是一种源自 SARS-CoV-2 七肽重复序列 2 区的 36 个氨基酸泛冠状病毒融合肽抑制剂，目前正处于 I 期 COVID-19 试验。尽管抗病毒肽抑制剂具有显著的效力和低毒性，但口服生物利用度低、代谢不稳定和循环时间短可能限制了它们的应用。抑制HIV-1侵入的恩夫韦肽是唯一FDA批准的抗病毒肽，但现在很少在临床实践中推荐使用。未来的研究需要确定具有更好的药代动力学/药效学（PK / PD）特性和给药途径的肽抑制剂。

热稳定设计的锚蛋白重复序列蛋白（DARPins），如ensovibep、FSR16m和FSR22（补充表1）靶向SARS-CoV-2刺突以阻断刺突-ACE2相互作用。提前终止的III期ACTIV-3/TICO试验显示，ensovibep（MP0420）对COVID-19住院患者没有临床益处。然而，II/III 期EMPATHY试验显示，ensovibep对有症状的 COVID-19 门诊患者有临床益处 （NCT04828161）。综上所述，DARPins可以提供抗病毒选择，不过仍需要优化。

木瓜蛋白酶（PLpro）是一种半胱氨酸蛋白酶，它不仅可以切割pp1a和pp1ab多蛋白以释放病毒蛋白NSP1，NSP2和NSP3（补充图 1a），还可以从信号蛋白中去除宿主泛素和泛素样干扰素刺激的基因15（ISG15）以抑制先天免疫反应。PLpro催化位点包含一个经典的催化三联体（Cys111-His272-Asp286），其优先切割相邻病毒蛋白（NSP1-NSP2，NSP2-NSP3，NSP3-NSP4）中的四肽基序LXGG↓XX以及细胞泛素和ISG15的C端尾巴（补充图1b）。在距离催化位点近 15 Å 处，一个被称为阻断环2 (BL2)的柔性β-发夹环控制着基质进入催化位点（补充图1b）。

图S1 |SARS-CoV-2木瓜蛋白酶及其药物结合口袋

a，pp1a和pp1ab多蛋白中木瓜蛋白酶（PL pro）和主蛋白酶（Mpro）的切割位点。PLpro还切割ISG15和泛素的C端尾部，将它们从信号蛋白中去除，从而抑制先天免疫反应。

b，SARS-CoV-2 PLpro的蛋白结构（PDB：7RBS）。底物基序LRGG位于具有催化三联体（Cys111−His272−Asp286）的活性位点。阻塞环路 2 （BL2） 的结构以红色表示。来自参考基因组的PL pro切割位点序列和BL2序列显示在右侧的框中。

c，三类PLpro抑制剂和VIR250（PDB：6WUU），XR8-24（PDB：7LBS），HE9（PDB：7OFU）的药物结合口袋。HE9靶向变构口袋，以阻止PLpro与ISG15的结合。

据报道，已有30多种有效的PLpro抑制剂（补充表1）。根据其作用机制，PLpro抑制剂可分为三组：（i）类，与催化半胱氨酸形成C-S硫醚键的共价抑制剂;（ii）类，阻止PLpro底物进入催化位点的非共价抑制剂;（iii）类，靶向变构结合口袋的非共价抑制剂（补充图 1c）。在（i）类中，共价抑制剂，如VIR250和VIR251是模仿四肽基序LXGG以抑制PLpro肽酶活性的拟肽剂。LXGG基序的“无特征”两个甘氨酸残基使得开发有效的拟肽抑制剂变得困难，因为只有P1和P2位置有两个甘氨酸残基的肽底物可以容纳在底物结合口袋内。在（ii）类中，非共价抑制剂如GRL0617、F0213、吖啶黄素、Jun9-72-2、Rac3k和XR8-24（补充表1）占据BL2槽以阻塞底物用于进入催化位点的通道。由于BL2沟的序列和结构差异，这些抑制剂中的大多数似乎只抑制SARS-CoV和SARS-CoV-2，而不能抑制MERS-CoV（补充图 1b）。F0213是一个例外，它抑制SARS-CoV-2和MERS-CoV PLpro，可能是通过靶向BL2槽66附近的狭窄底物结合袋。在第（iii）类中，HE9等非共价抑制剂靶向变构口袋（距离催化位点30 Å），以阻止ISG15和泛素与PLpro的结合（补充图1c）。双硫仑等锌-喷射药物阻断PLpro的变构Zn2+结合口袋。应广泛评估变构PLpro抑制剂的选择性和毒性，因为锌喷射剂可能会干扰人体内的含锌蛋白，并且ISG15结合口袋也存在于人泛素特异性肽酶18（USP18）中。

PLpro抑制阻断病毒蛋白成熟并恢复人体免疫反应。然而，选择性PLpro 抑制剂的设计具有挑战性，部分原因是PLpro在结构上类似于人类去泛素化酶（DUB）和DUB样蛋白酶家族，它们也识别泛素或泛素样蛋白。也有DUB和DUB样蛋白酶作为其他人类疾病的治疗靶点的研究，但尚未批准这些蛋白质的抑制剂。未来的发展可能集中在（ii）类非共价PLpro抑制剂上，并进行广泛的优化，可提高选择性和效力，并减少与人类同源DUB和DUB样蛋白酶的交叉反应。

SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro），也称为3C样蛋白酶，是一种半胱氨酸蛋白酶，可切割pp1a和pp1ab多蛋白以将病毒蛋白NSP4释放至NSP16（图 4a）。抑制 Mpro介导的蛋白水解裂解可阻断关键病毒酶（如NSP12和NSP13）的成熟，从而阻断随后的病毒复制（图2）。SARS-CoV-2 Mpro 同型二聚体更倾向于水解 Gln↓（Ser/Ala/Asn） 的 P1 位置的谷氨酰胺残基（图 4a）。虽然没有已知的宿主蛋白酶具有与Mpro 相同的初级切割位点，但一些人半胱氨酸蛋白酶（如组织蛋白酶B，K，L和S）也可以在Gln残基的C端切割;因此，在开发Mpro抑制剂时需要考虑潜在的交叉特异性。

图4：严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型主要蛋白酶及其药物结合口袋的结构

a，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）主要蛋白酶（Mpro）功能结构域、蛋白质结构和切割序列。Mpro 二聚体是活性形式（PDB：7VU6）。pp1a和pp1ab多蛋白中相邻NSP4和NSP5之间的切割序列“AVLQ↓SGFR”位于由Cys145和His41（PDB：7DVP）形成的Mpro 催化二元组中。 来自参考基因组的Mpro 切割序列如右图所示。 

b， Mpro催化位点处于预裂解状态，具有NSP4−NSP5裂解序列（PDB：7DVP）。可以开发具有P1′弹头，P1，P2，P3和P4基团的Mpro抑制剂，以最大化Mpro的S1′，S1，S2，S3和S4亚位点的药物-受体相互作用。

c，四类Mpro抑制剂和nirmatrelvir（PDB：7VH8），14c（PDB：7T4B），ensitrelvir（PDB：7VU6）和x1187（PDB：5RFA）的药物结合口袋。还显示了通过催化二元组Cys145−His41对nirmatrelvir的可逆共价抑制。x1187的药物结合口袋在二聚体界面处被捕获（见图a）。

d，从PF-00835231开发nirmatrelvir。Nirmatrelvir和boceprevir在骨架和P2/P3部分具有相同的结构。从文献中获得PF-00835231、nirmatrelvir和boceprevir对SARS-CoV-2 USA_WA1/2020的半数最大有效浓度（EC 50）值和口服生物利用度（口服F）在大鼠中的一半最大有效浓度（EC 50）值。

Mpro同源二聚体的每个亚基都具有一个催化二元组，其由位置145（Cys145）的亲核半胱氨酸和位置41（His41）的组氨酸残基形成。Mpro催化二元组催化Cys145硫代酸盐与底物P1谷氨酰胺75的主链羰基之间形成共价碳硫键（图 4b）。与HIV-1和丙型肝炎病毒（HCV）蛋白酶抑制剂的基于结构的合理设计类似，各种小分子Mpro抑制剂被设计为最大化药物受体相互作用，特别是通过与Mpro的S1 '， S1, S2, S3和S4亚位的主链原子形成广泛的相互作用（图4b）。

已有超过100种Mpro抑制剂被报道，包括主要候选药物，如nirmatrelvir，ensitrelvir和SIM0417（补充表1）。Mpro抑制剂可分为四组（图 4c）。基于其作用机制：类（i），与Mpro催化口袋共价结合的拟肽抑制剂；类（ii），通过共价相互作用阻断M pro催化袋的非拟肽抑制剂；类（iii），通过非共价可逆相互作用占据Mpro底物结合口袋的正构抑制剂；和 （iv） 类非共价抑制剂，靶向变构位点，主要破坏 Mpro 二聚体的形成。

在（i）类中，拟肽共价抑制剂通常带有亲电弹头，如腈（如nirmatrelvir），酮（如PF-00835231），α-酮酰胺（如化合物13b-K），醛（如化合物18p）或迈克尔受体（如化合物N3），以与Mpro的催化Cys145形成共价键（补充表1)。Nirmatrelvir是一种拟肽剂，其含有与Cys145共价键合以实现可逆抑制的丁腈弹头（图4c）。在细胞培养中，Nirmatrelvir抑制所有7种人类冠状病毒(HCoV)野生型78和各种SARS- CoV-2变体，并显着降低小鼠和仓鼠的病毒载量。

在II/III期EPIC-HR研究中，在高风险、未接种疫苗、未住院的轻中度COVID-19成人患者中，早期使用尼玛特瑞韦300毫克、加利托那韦100毫克，每日2次，持续5天，可降低COVID-19相关住院率（nirmatrelvir-利托那韦：0.77%，安慰剂：6.31%）和28天全因死亡率（nirmatrelvir-ritonavir：0%，安慰剂：1.15%）。根据EPIC-HR研究，利托那韦增强剂nirmatrelvir（作为Paxlovid上市）于2021年12月在美国获得了首个EUA，随后在许多国家获得批准或授权。现在推荐将Paxlovid作为轻度至中度COVID-19且进展为重度COVID-19高风险的门诊患者的早期治疗（表1）。然而，初步研究表明，在Paxlovid治疗后，COVID-19偶尔会反弹，而Mpro中的E166V等自然发生的突变可能会赋予对nirmatrelvir和ensitrelvir 92的耐药性。不推荐Paxlovid用于有严重肾脏或肝脏损伤或有临床显着超敏反应史的患者，也不推荐用于服用引起显着药物相互作用的禁忌药物的患者。未来的研究应监测影响nirmatrelvir-ritonavir效力和安全性的耐药突变和药物相互作用（例如，与CYP3A4诱导剂）。

由NSP12编码的SARS-CoV-2 RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）是一种高度保守的全酶，参与病毒RNA复制和转录。在Mpro介导的蛋白水解处理后，成熟的NSP12与病毒复制-转录复合物93中的其他非结构蛋白（NSP7至NSP10，NSP13至NSP16）配合（图5a），催化模板解旋、RNA合成、RNA校对和RNA加帽。通过靶向复制-转录复合物的关键成分（图5b）、可开发一系列抗病毒药物来阻断RNA合成（NSP12 RdRp 抑制剂）、模板展开（NSP13 解旋酶抑制剂）、RNA 校对（NSP14 外切核糖核酸酶抑制剂）、尿苷切割（NSP15 内切核糖核酸酶抑制剂）和 RNA 加帽（NSP9 抑制剂、NSP12 NiRAN 抑制剂、NSP13 ATP 酶抑制剂、NSP14 鸟嘌呤-N7-甲基转移酶抑制剂和 NSP16 2′-O-甲基转移酶抑制剂）。NSP12抑制剂将在本节中描述，而其他抑制剂将在后面讨论。

SARS-CoV-2解旋酶是1B解旋酶超家族的成员，具有RNA解绕和腺苷5′-三磷酸酶（ATPase）活性。解旋酶结构包括一个协调锌离子的N端锌结合结构域；具有两个RecA样结构域的C端RNA结合ATP酶；以及桥接N端和C端结构域的茎和1B结构域。螺旋柄和1B结构域的动态结构不太可能是可成药的，但RNA结合位点和ATP酶活性位点（补充图 2）已被鉴定为保守的药物结合口袋。

图 S2 | NSP13的结构及其药物结合口袋

NSP13解旋酶的功能域（PDB：7RDY）。一个药物结合口袋位于ATP/ADP结合位点内，腺苷酰亚胺二磷酸（一种不可水解的ATP类似物）阻断ATP/ADP结合位点（PDB：7NN0）。另一个位于RNA结合位点内，实验抑制剂POB0066阻断病毒ssRNA的进入（PDB：5RMM）。

据报道，一些小分子先导物可抑制解旋酶RNA展开（如FPA-124和2-苯基喹啉衍生物）和/或ATP酶活性（如5645-0263和雷尼替丁柠檬酸铋）（补充表1）。然而，需要进一步优化以解决脱靶毒性和效力有限的问题，因为SARS-CoV-2和一些宿主解旋酶（如人DDX解旋酶）具有相似的底物结合结构和功能，包括双链RNA展开和NTP酶水解。尽管尚未有解旋酶抑制剂进入COVID-19的临床试验，但已经开发出针对其他传染病的强效解旋酶抑制剂，包括在日本被批准用于带状疱疹治疗的amenamevir和普利特利韦，该试验正在招募感染阿昔洛韦耐药单纯疱疹病毒的免疫功能低下患者（NCT03073967）。

SARS-CoV-2 NSP14具有N端外切核糖核酸酶结构域和C端鸟嘌呤-N7-甲基转移酶结构域（补充图 3a）进行病毒RNA校对和加帽，分别为NSP14的外切核糖核酸酶结构域与其辅因子NSP10相互作用，作为3′–5′外切核糖核酸酶，通过从新生RNA链的3′末端去除错误并入的核苷酸或核苷酸类似物来纠正病毒RNA错配。这种校对机制对于维持长SARS-CoV-2基因组的复制保真度是必不可少的。它还限制了利巴韦林等核苷（t）ide抑制剂的有效性，因为NSP14外切核糖核酸酶从病毒RNA中快速切除利巴韦林5′-单磷酸。靶向外切核糖核酸酶活性位点的NSP14抑制剂已被鉴定，例如化合物#79，A-2和B-1（补充表1），但由于NSP14和人DEDD核酸外切酶之间的结构相似性，应仔细评估这些抑制剂的脱靶效应。

图 S3 | NSP14的结构及其药物结合口袋

a， NSP14 功能域。NSP14 / NSP10与病毒dsRNA（PDB：7N0D），GpppA₁和SAM（从PDB：5C8S修改）复合物可视化。两个药物结合口袋位于外核糖核酸酶和鸟嘌呤- n7甲基转移酶结构域的催化位点。突出显示了N7-MTase抑制剂化合物25 [3]和ExoN抑制剂化合物#79 [4]。 我们感谢纽约大学的Andras Zeke博士在NSP14加化合物#79的子图上的创造;来自蒙彼利埃大学的Rostom Ahmed-Belkacem博士与化合物25共享NSP14的PDB文件。

b，NSP14甲基转移酶将甲基从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移到其底物病毒GpppA 1-RNA，在病毒RNA加帽过程中产生m 7GpppA 1-RNA（参见图5b中的所有过程）。

NSP14鸟嘌呤-N7-甲基转移酶参与病毒RNA帽结构的构建，该结构可防止病毒RNA降解和抗病毒免疫激活。它将甲基从S-腺苷基-l-蛋氨酸（SAM）供体转移到新合成的病毒RNA的鸟苷5′-三磷酸的N7位置，产生Cap-0-RNA结构（补充图 3b）。基于磺酰胺的双底物类似物化合物含有用于阻断SAM结合口袋的腺苷和用于占据帽结合口袋的3-氰基-4-甲氧基苯磺酰胺环。其他N7-甲基转移酶抑制剂（如吡啶抑素、西尼芬苷和DS0464）在细胞培养中也表现出适度的抗SARS-CoV-2活性（补充表1）。目前尚无NSP14抑制剂进入COVID-19的临床试验。

NSP15是一种尿苷特异性内切核糖核酸酶（补充图4a）在负义病毒RNA中切割5′-聚尿苷束（补充图4b）逃避宿主免疫反应的激活。NSP15 Mn2+依赖性核糖核酸内切酶的活性位点，其切割病毒RNA底物并产生2′，3′-环磷酸二酯和5′-羟基末端是一个潜在的药物结合口袋（补充图 4c）。迄今为止确定的抑制剂（补充表1），例如替匹嘧啶，一种被批准用于治疗结直肠癌的尿嘧啶衍生物，对SARS-CoV-2的活性较弱（补充图4d），需要进一步优化。理论上，NSP15内切核糖核酸酶可能是一个有吸引力的抗病毒靶标，因为缺乏密切的人类同系物。

图S4 |NSP15的结构及其药物结合口袋

a，NSP15单体的功能结构域由N端结构域，中间结构域和C末端核糖核酸内切酶（endoU）结构域组成。NSP15催化位点位于endoU结构域内。

b， 六个NSP15单体形成一个六聚体（PDB：7TQV），可识别尿苷并从双链或单链病毒RNA中切割聚尿苷尾巴。

c， NSP15六聚体的一个亚基靶向双链RNA的尿苷（PDB：7TQV）。

d， NSP15药物结合口袋被称为替匹嘧啶（PDB：6WXC）的尿嘧啶衍生物阻断。

SARS-CoV-2 NSP16及其激活剂NSP10形成异二聚体2′-O-甲基转移酶复合物（补充图 5）有效地将病毒RNA从Cap-0-RNA转换为Cap-1-RNA配置，以逃避模式识别受体的激活。尽管S-腺苷-l-高半胱氨酸（SAH）和SAM衍生物（例如sinefungin）在细胞培养中具有抗SARS-CoV-2活性，但通常具有较差的膜通透性（由于其两性离子性质）和高毒性（由于人类甲基转移酶，例如帽特异性mRNA（核苷-2′-O-）-甲基转移酶1（CMTR1）），因此限制了其临床应用。

图S5 | NSP16/NSP10的结构及其药物结合口袋

a，NSP16  2′-O-甲基转移酶及其激活剂NSP10形成异二聚体复合物，以有效地将病毒RNA从Cap-0-RNA转换为Cap-1-RNA构型。图中显示了催化位点内的SAM（PDB：7JYY）和SAH（PDB：7L6T）。

b， NSP16的催化位点通过将甲基从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移到底物Cap-0-RNA上，使新生SARS-CoV-2 RNA  中第一个核苷酸（通常是腺苷）的核糖2′-O甲基化。

c， NSP16催化位点内的药物结合口袋。Sinefungin模仿SAM结构以 竞争性阻 断病毒RNA加帽的2′-O甲基化（PDB：6YZ1）。

NSP16 与人 CMTR1 具有结构同源性，可促进 SARS-CoV-2 RNA 甲基化作为替代途径。一种称为 3-脱氮烷匮菌素 A 的实验性腺嘌呤类似物通过协同阻断 NSP16 2′-O-甲基转移酶和人 CMTR1 来抑制 SARS-CoV-2 复制 ，但会引起不良影响，例如啮齿动物生长迟缓和肾毒性。原则上，抑制 SARS-CoV-2 RNA 甲基化需要同时靶向 NSP16 和 CMTR1，并且可能具有很高的毒性风险，因为抑制人 SAM 循环相关酶会损害人类 mRNA 成熟。

SARS-CoV-2核衣壳是一种灵活的多价蛋白（补充图6），具有多种功能，包括病毒基因组包装153  和抑制先天抗病毒免疫。然而，开发核衣壳抑制剂仍然是一个挑战。首先，与病毒蛋白酶和RdRp不同，核衣壳中的药物结合口袋似乎是动态结构，因此难以进行稳定的药物结合。其次，核衣壳是最丰富的SARS-CoV-2蛋白，并与病毒RNA折叠成复杂的核糖核蛋白复合物。第三，目前的核衣壳抑制剂在抗病毒效力和结合亲和力方面不如蛋白酶和RdRp抑制剂。尽管在过去30年中进行了积极的研究，但尚未批准抗病毒核衣壳抑制剂。

图S6 | 核衣壳的结构及其药物结合口袋

a， SARS-CoV-2核衣壳的功能结构域。

b， 与病毒单链RNA复合的RNA结合结构域（PDB：7ACT）。实验抑制剂PJ34（PDB：4KXJ）的药物结合口袋位于RNA结合结构域和病毒ssRNA之间的相互作用界面内。 

c， SARS-CoV-2核衣壳二聚体与GTP复合物的二聚结构域（PDB：7O35）。假设的药物结合口袋位于两个亚基之间。病毒RNA包装是通过核衣壳二聚体、病毒基因组RNA和病毒膜蛋白的寡聚化介导的。

NPS1、NSP6、NPS7和NSP9等非结构蛋白也被探索为抗病毒靶标（补充表1）。然而，其潜在抑制剂的特异性和效力（主要来自药物再利用）需要进一步改进和评估。SARS-CoV-2辅助蛋白（如开放阅读框3a（ORF3a）、ORF6和ORF9b）参与多种功能，包括病毒复制、免疫逃避、自噬和/或细胞凋亡。尽管已经筛选了一些化合物来抑制SARS-CoV-2辅助蛋白（补充表1），但这些蛋白质通常是病毒生命周期的可有可无的。