【科技前沿】上海科技大学免化所张璐/饶子和组与英国合作者揭示结核分枝杆菌细胞壁AG合成起始阿拉伯糖基转移酶AftA的三维结构

2023-06-13 18:06

美国当地时间5月30日，上海科技大学免疫化学研究所张璐研究员/饶子和院士团队与英国伯明翰大学Gurdyal S. Besra院士团队在国际著名期刊《美国科学院院刊》（PNAS）在线联合发表了题为“Structure of the priming arabinosyltransferase AftA required for AG biosynthesis of Mycobacterium tuberculosis”的研究论文，率先解析了结核分枝杆菌细胞壁重要组成成分阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan, AG）合成通路中起始阿拉伯糖基转移酶AftA的三维结构，提出了AftA蛋白催化阿拉伯糖起始合成的选择特异性，对于理解结核杆菌细胞壁组装机制，阐明AftA作为潜在抗结核新靶点的工作机制和靶向性药物研发提供了理论基础。

结核病由结核分枝杆菌（Mtb）感染引起，长期以来一直是造成感染人数和死亡人数最多的单一传染病。尽管化疗药物治疗可以追溯到20世纪50年代，但结核病至今仍然是传染病死亡的主要原因，特别是耐药结核和HIV共感染等给结核病防治和公共卫生安全带来了前所未有的压力。结核分枝杆菌是高度复杂和独特的细胞壁主要由糖类、脂类和糖脂类分子组成，是病原体生长所必需，同时也是造成致病性和耐药性的关键因素之一。其核心骨架由AG外连分枝菌酸（Mycolic Acids, MA），内连肽聚糖（Peptidoglycan, PG）构成，抑制细胞壁成分的合成被认为是合理的抗结核新药研发思路。当前使用的一线抗结核药物异烟肼、乙胺丁醇等均是通过抑制细胞壁合成发挥作用的，但一线药物不同程度产生耐药性，因此针对抗结核药物靶点的研究以及新药的研发迫在眉睫。

AftA是细胞壁AG生物合成的一种必需的膜蛋白糖基转移酶，它负责起始转移第一个阿拉伯呋喃糖残基从供体癸烯基单磷酸阿拉伯糖（DPA）到成熟的半乳聚糖链上，起到桥联阿拉伯聚糖和半乳聚糖合成的作用，对维持细菌体外生长和细胞壁结构完整性至关重要，因此AftA是一个非常有潜力的药物靶点。AftA属于糖基转移酶C（GlycosylTransferase C, GT-C）超家族成员，与此前该团队解析的一线药物乙胺丁醇靶点Emb蛋白属于同家族。

图1. Mtb细胞壁主要成分结构的示意图，AftA催化第一个阿拉伯糖基残基从供体DPA转移到半乳聚糖链

冷冻电镜结构显示AftA以二聚体的形式组装，与此前解析的EmbA-EmbB或EmbC₂紧密结合的二聚体相比，两个AftA分子沿着垂直于膜平面的轴相对旋转，这种旋转导致更开放的AftA二聚体组装模式。通过基于结构指导的分子间交联实验，研究团队证实AftA在分枝杆菌细胞膜上存在二聚体形式，与解析出的结构相一致。每个AftA分子包含由13根跨膜螺旋组成的N末端跨膜结构域（Transmembrane domain, TMD）和C末端可溶性结构域（C-terminal domain, CTD）。结构中发现一个钙离子处于TMD和CTD之间，作用可能是维持酶结构完整性。

研究团队将AftA结构与GT-C家族蛋白质进行系统性结构比对分析，找到GT-C类酶保守的由11跟跨膜螺旋组成的跨膜区核心结构域（GT-C core）和由5个α螺旋与5个β片层（α₅β₅）组成的可溶区GT-C core。AftA蛋白在催化活性位点两侧形成两个空腔，通过和同家族蛋白质结构比对和功能实验验证，研究团队首先鉴定出了供体底物DPA的结合口袋和磷酸基团作用位点，找到高度保守的催化关键氨基酸Asp128位于两根跨膜螺旋（TM3-4）之间的胞外横螺旋起始处。为了揭示AftA的半乳聚糖受体选择机制，研究团队利用体外糖基转移酶活性实验证实了直链的八聚半乳糖苷（LG8）是AftA的功能性受体；AftA负责在LG8的内部第6个呋喃半乳糖基残基的C-5位羟基上催化与供体阿拉伯糖的糖苷键形成，从而起始AG的阿拉伯糖合成。在此基础上研究团队对糖受体LG8与AftA蛋白进行了分子对接，结果显示LG8结合在推测的受体结合口袋，并且其6位半乳糖通过其O5原子与AftA催化活性位点Asp128侧链形成一个氢键而进入AftA活性位点，并在此基础上提出AftA催化的工作机制。此项工作还表明，尽管与EmbA/B/C酶属于同一GT-C超家族，AftA却不受乙胺丁醇的抑制，因此以AftA为新药靶点有望解决目前乙胺丁醇的耐药问题。

（A）AftA的电势密度图（B）AftA二聚体的卡通模型。（C）中间AftA结构中的两个空腔，其中右侧空腔为供体结合口袋，通过结构比对，糖供体的磷脂部分位于所提出的供体腔内；左侧空腔为受体结合口袋，通过分子对接获得受体LG8结合的结构。

上海科技大学免疫化学研究所张璐课题组一年级（2022级）博士研究生龚宜诚为本论文的第一作者。张璐研究员和英国伯明翰大学Gurdyal S. Besra院士为该研究论文的共同通讯作者。清华大学教授兼上海科技大学免疫化学研究所特聘教授饶子和院士和上海交通大学达林泰教授为共同作者，免化所副研究员杨秀娜和赵耀也参与了此项研究。上海科技大学为第一完成单位，电镜数据收集在上科大生物电镜平台完成，本研究得到了上海科技大学、临港实验室和英国医学研究委员会的支持。值得一提的是，此项工作是免疫化学研究所抗结核结构研究中心饶子和/张璐和伯明翰大学Besra联合攻关团队聚焦抗结核细胞壁合成膜蛋白靶点的又一项重要成果，为系统性理解Mtb独特复杂的细胞壁组装的分子机制和靶向细胞壁的抗结核新药发现提供结构基础。此前该团队成功攻克长达半个世纪的乙胺丁醇药物作用靶点EmbA/B/C的结构解析难题，揭示乙胺丁醇作用的分子机制（Science，2020），获得中国2020年度重要医学进展。