Mol Cell | 上海科技大学季泉江开发新颖微型Cas12n基因编辑系统

几乎所有的古生菌和许多细菌都含有CRISPR相关系统(Cas)，作为抵抗入侵病毒和其他移动遗传因子的适应性免疫机制。CRISPR-Cas蛋白序列及其基因组位点结构高度多样化，目前可分为两类，包括6大类型和30个亚型。1类系统(I、III和IV型)包含多亚基效应复合物，2类系统包含单一、多结构域和全功能的蛋白质效应物(例如，II型Cas9、V型Cas12和VI型Cas13)，使它们成为各种基因编辑应用的有吸引力的工具。

与Cas9核酸酶具有分离的HNH和RuvC核酸酶结构域用于双链DNA (dsDNA)切割不同，Cas12家族核酸酶具有单个RuvC结构域用于DNA干扰。最近和正在进行的计算发现和实验表征使得涉及V型效应器的可用工具包得到了极大的扩展。在发现Cas12a之后，一系列Cas12效应蛋白，包括Cas12b/Cas12c、Cas12d/Cas12e、Cas12g/Cas12h/Cas12i、Cas12l、Casπ、以及噬菌体衍生的Cas12j (CasΦ)和Casλ被鉴定和表征。

五种微型Cas12变体(V-U1到V-U5)被分类，这些现在已知具有不同的生物学功能。Cas12m (V-U1)缺乏靶向特异性和侧链核酸酶活性，通过dsDNA结合来沉默入侵基因表达来执行保护功能，Cas12f1 (V-U3)是一种二聚体dsDNA切割核酸酶，被设计为一种通用的基因组编辑器，Cas12k (V-U5)是一种催化无活性的T7样转座子相关CRISPR效应物，介导程序化的位点特异性RNA引导的DNA转位。其余两个微型系统(V-U2和V-U4)的生化特性和生理功能尚不清楚。

最近，Cas12家族核酸酶的祖先，转座子编码的IS200/IS605家族蛋白TnpB，被证明是一种RNA引导的DNA切割核酸酶，并在人类细胞中被设计为基因组编辑器。目前，TnpB被认为是一种单体核酸酶，由源自TnpB 3 '端的ωRNA引导。尽管TnpB具有保守的RNA引导的DNA切割功能，但即使与目前已知的最接近的Cas12f1核酸酶，TnpB在几个方面也存在显著差异。Cas12f1核酸酶是一种由分离的单导RNA (sgRNA)引导的二聚体蛋白，具有5 ' t丰富的原间隔器邻近基序(PAM)特异性，并在目标DNA中产生三次切割(两次切割事件发生在非目标链上，一次发生在目标链上)。TnpB和Cas12家族核酸酶之间的显著差异表明存在更早的进化中间产物，对其进行挖掘可能有助于开发先进的基因组操作技术。

Cas12n的进化路线、工作机理和应用（图源自Molecular Cell ）

该研究通过聚类和系统发育分析，确定了微型V-U4 C2C9核酸酶(以下简称Cas12n)是TnpB最近的邻居。随后的表征表明，Cas12n可能是一种单体核酸酶，它能识别独特的5 ' -AAN PAM序列，并在源自Cas12n基因3 '端的sgRNA的指导下在靶DNA中产生两次切割。Cas12n核酸酶的这些生化特征与祖先蛋白TnpB高度相似，这支持了Cas12n可能是TnpB和大型Cas12核酸酶之间最早的进化中间体的猜测。此外，该研究工作证明了Cas12n核酸酶在细菌和人类细胞中的基因组编辑能力，并利用系统sgRNA工程设计了一种高效的CRISPR-Cas12n系统(称为Cas12Pro)，在人类细胞中具有高达80%的indel效率。最后，该研究证明Cas12Pro可以通过融合脱氧腺苷脱氨酶在人类细胞中进行碱基编辑。总的来说，该研究结果促进了对V型CRISPR进化机制的理解，并扩展了用于治疗应用的微型CRISPR工具箱。

来源：iMedicines

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