南美小山猴和澳洲袋鼠
自《物种起源》发表以来，演化的思想已经深入人心。全基因组测序技术的飞速发展，使得科学家们能够透过DNA这本 “生命之书” 一窥生物演化的传奇史诗。然而随着研究的不断深入，演化中的 “历史遗留问题” 逐步显现：基于表型数据或遗传数据偶尔会得出相互矛盾的结果。在今年4月发表于《细胞》杂志的最新研究中，科学家们以有袋类动物为例，论证了在物种快速分化过程中，基因组中的不完全谱系分流现象可以引起远缘物种具有相似的表型特征，进而影响演化关系的推断。因此他们提出，仅仅通过少数基因或表型特征来推断物种的演化关系并不可靠，全基因组数据才能准确反映出真实的演化历史。1837年7月，结束了跟随 “小猎犬号” 的环球航行后，一位年轻的博物学家打开自己的笔记本，写下了 “我认为（I think）” 并信笔涂鸦了一个简单的图案。当时的他也许并未意识到，这个不经意萌发出的思考，即将引领人类文明史上一场轰轰烈烈的思想变革。他的名字和他的理论体系，也将成为后人探索生命世界的灯塔和海图（图1）。图1 达尔文的笔记 | 图源[1,2]
经过近两个世纪，“生命之树” 的概念已经深入人心。最初的生命如同一颗破土而出的幼芽，随着时间推进而茁壮成长、开枝散叶，最终形成了如今多姿多彩的生命世界——这样一个简洁而诗意的意象，也似乎可以回答人们对自身起源的长久追问。然而，随着人们对生物演化的研究从形态进入分子领域，研究者们越发意识到，实际的演化过程远比树形分支复杂得多，不仅根据表型得出的演化关系与实际的基因组演化大相径庭，甚至DNA这本 “生命之书” 的不同章节都可能得出相互矛盾的结论。今年4月发表于《细胞》杂志的一篇研究中，研究人员解析了关键有袋类哺乳动物的演化关系，并验证了不完全谱系分流（incomplete lineage sorting，ILS）对表型演化的影响 [3]。
在树形图中，物种分化过程可能就是一个二叉树上的节点，但在现实世界里，它既不是在某时某分某秒立刻发生的，也不是一根线变成两根线这种单一且同质的事件。如果将物种比作一个容器，那么它的基因组就像是装在这个容器中的一组带编号的球：每个编号都有自己的多种颜色和演化路径。物种分化时，容器一分为二，容器中的球也会随之被重新分配（图2）。虽然大多数球都会和新容器的分化路径保持一致，但也难免会有一些球被 “放错”——也就是基因组的部分区域（球）与物种（容器）的演化路径不尽相同。图2 “放错”球与演化关系推断。1号球的分配方式与容器的演化路径一致，基于1号球的颜色推断A、B、C三个容器的亲缘关系时，也很自然地认为B和C更近；2号球的分配方式与容器的演化不一致，B偶然间保留了与A相同颜色的球，因此从2号球的颜色判断，A和B的亲缘关系更近，与真实的关系矛盾 | 本文作者制图
这种容器中有很多不同球的现象，学术界称为 “祖先多态性（ancestral polymorphism）”，而由祖先多态性导致的、基因树（球的演化历史）与物种树（容器的演化历史）不一致的情况，就称为 “不完全谱系分流”。如果物种的分化过程足够长，祖先物种有充足的时间可以固定自己特有的变异，新物种在继承祖先变异后再各自固定变异，传递给下一代物种……在这个过程中，物种之间的远近亲疏十分明确，很少会出现右图中那种 “放错球” 的现象。但是，如果物种分化过程非常快，短期内分化出大量物种，祖先还来不及固定某种变异，就已经产生了更新的下一代。这样一来，新的物种就有可能随机保留了某种祖先的变异——此时，“放错球” 就会频频出现，进而影响通过这些变异推导出的亲缘关系。所以，物种快速分化的过程常常伴随着不完全的谱系分流。
有袋类（marsupials）是一种特殊的哺乳动物，以雌性特有的育儿袋著称，包含了袋鼠、考拉、负鼠等动物。有袋类分布于澳洲和南美洲、中美洲，但是澳洲和美洲之间有大洋相隔，如今的分布是如何形成的呢？这就需要根据可靠的物种树来推断其演化历史。不过，有袋类在演化早期经历过一个快速的物种分化过程，使得一些深度分支的关系难以厘清，其中争议的焦点之一就是微兽目（Microbiotheria）的演化地位。微兽目下只有一个现生物种——小山猴（Dromiciops gliroides，monito del monte），分布于南美洲的智利和阿根廷（图3）。图3 小山猴生态照 | 图源[4]
尽管小山猴分布于南美洲，但它的许多解剖学特征（踝骨关节、生殖器官、大脑结构）与澳洲的有袋类动物，特别是袋鼠目（Diprotodontia，又称双门齿目）更为相似。早前有使用线粒体基因和形态数据的分析认为，分布于南美的小山猴是澳洲有袋类的下属分支（图4）[5]。另有基于形态的研究，虽然也将小山猴放在了澳洲有袋类中，但与澳洲有袋类各个目的关系却与前面的研究并不一致 [6]。最新的演化分析则认为，小山猴是澳洲有袋类的姐妹群（sister taxon），即澳洲有袋类形成一个整体，而小山猴是与之最近缘的分支（图5）[7]。图4 小山猴的分类地位假说一：位于澳洲有袋类内。绿色为分布于南美洲的物种，蓝紫色为分布于澳洲的物种 | 图源[5]
图5 小山猴的分类地位假说二：澳洲有袋类的姐妹群。灰色为分布于南美洲的物种，黑色为分布于澳洲的物种 | 图源[7]
那么，真实的演化历史是什么样的呢？为什么会出现这种矛盾呢？
在新发表的研究中，研究者获取了小山猴的全基因组数据，并选取了分布于澳洲的袋鼠目（Diprotodontia，以下简称Dipr）物种树袋熊（koala）、尤金袋鼠（tammar wallaby）和袋鼬目（Dasyuromorphia，以下简称Dasy）物种袋獾（Tasmanian devil）、棕袋鼩（brown antechinus），以及分布于南美洲的负鼠目（Didelphimorphia）物种灰色短尾负鼠（gray short-tailed opossum）进行比较基因组分析。图6 小山猴与澳洲有袋类的三种演化关系 | 图源[3]
结合前人的研究结论，在本研究中，小山猴所代表的微兽目（以下简称Micr）的演化地位存在三种可能性（图6）：
1 Dipr_Dasy树-澳洲的两种有袋类亲缘关系最近，分布于南美的小山猴是澳洲有袋类的姐妹群；
2 Dipr_Micr树-小山猴与袋鼠目的亲缘关系更近；
3 Dasy_Micr树-小山猴与袋鼬目的亲缘关系更近。
图7 使用全基因组同源比对区构建的系统发生树 | 图源[3] 绘图：丁弋
研究人员发现，全基因组数据支持小山猴是澳洲有袋类动物的姐妹群（图7），因此 Dipr_Dasy 树被认定为反映小山猴真实演化历史的物种树。
虽然基因组整体支持了物种树，但并不意味着局部区域也与之保持一致。研究人员在有袋类物种的基因组中发现了大量不支持物种树的区域。在这些区域上，小山猴的基因组嵌在了澳洲有袋类的内部，要么是跟尤金袋鼠和考拉更相似，要么跟袋獾和棕袋鼩更相似。进一步的分析揭示，这种现象来自于不完全谱系分流，且有袋类基因组有超过50%区域受其影响。“不完全的谱系分流所引发的祖先多态性的随机固定，可能会偶然地导致两个亲缘关系较远的物种继承相同的祖先基因型。如果不同的祖先基因型会产生不同的形态特征，那么这样一来，就可能会导致远缘物种具有更加相似的表型。” 本文第一作者、深圳华大生命科学研究院冯少鸿博士表示。他们发现，尽管小山猴与袋鼠和考拉并非近缘的谱系，但它们在肱骨弯曲的形态、胸椎T1与T2的棘突长度比、门齿形态等方面都更加相似（图8）。那么，这些宏观表型的相似性是否来自于基因组中大规模的不完全谱系分流呢？图8 本研究中各目代表动物的肱骨形态、脊柱棘突相对高度与门齿结构 | 图源[3] 绘图：丁弋
研究人员发现，受到不完全谱系分流影响的基因组区域包含了上百个与神经系统、免疫系统、骨骼形态等相关的基因，推测它们可能与物种表型的相似度与演化历史之间的矛盾有关。为进一步验证不完全谱系分流对远缘物种相似表型的贡献，他们使用小鼠为模型，利用基因编辑技术（CRISPR/Cas9），针对与脊柱发育相关的WFIKKN1基因和与肱骨发育相关的PAPSS2基因设计了相关验证实验。图9 Dipr_Micr的ILS信号（蓝色区域）在小山猴WFIKKN1基因上的分布 | 图源[3]
以WFIKKN1基因为例（图9）。小山猴、尤金袋鼠和考拉的胸椎前两节棘突的高度相似，它们此基因编码区第76个氨基酸均为谷氨酰胺（Q）。而负鼠、袋獾和棕袋鼩的胸椎前两节棘突高度的比值小于1，它们在此位置的氨基酸也均为精氨酸（R）。当研究人员将小鼠该位置的氨基酸从Q变为R时，表型也随之发生了相应的变化：与野生型小鼠（Q）相比，基因编辑小鼠（R）胸椎前两节棘突高度比值明显降低了（图10）。“这样的变化符合我们对不完全谱系分流会导致远缘物种具有更加相似的表型的预期。” 冯少鸿说。图10 Wfikkn1Q76R/Q76R小鼠与野生型小鼠的T1和T2棘突相对差异 | 图源[3]
生物的演化远非一张树形图那般简洁明了，基因组中遍布着 “历史遗留问题”。本研究表明，基因组中的不完全谱系分流现象会影响物种的表型相似性，进而影响演化关系的推断。“该文指出了一个重要问题。因为不完全谱系分流的存在，仅仅凭形态或部分基因的相似度判定亲缘关系可能会有问题。” 西北工业大学生态环境学院的王文教授表示，“在揭示物种间关系时，使用全面的比较基因组数据可能更有分辨率。”为了回答小山猴演化地位的问题，此项研究主要解析了六个关键代表性物种的演化关系。在澳洲分布的四个有袋类目级分类中，研究人员选取了袋鼠目和袋鼬目作为代表。“物种选取跟我们要追溯的祖先节点有关。” 冯少鸿告诉《知识分子》，“袋鼠目配袋鼬目、袋鼹目、袋狸目中的任意一个即可。袋獾和棕袋鼩基因组质量好，且一开始寻找骨骼标本的时候，也是它们的资源比较多。但是，如果想更精细地重建有袋类的演化历史以及分析不完全谱系分流对物种演化的影响，还需要更多的有袋类物种基因组数据。” 
致谢：感谢中国科学院动物研究所白明研究员为本文的撰写提供帮助和指导。
参考文献：（上下滑动可浏览）
1.Trees and networks before and after Darwin. Available from: https://www.researchgate.net/publication/38092957_Trees_and_networks_before_and_after_Darwin/figures?lo=1.
2.'Stolen' Charles Darwin notebooks left on library floor in pink gift bag. Available from: https://www.bbc.com/news/entertainment-arts-60980288.
3.Feng, S., et al., Incomplete lineage sorting and phenotypic evolution in marsupials. Cell, 2022.
4.Dromiciops gliroides. Available from: https://animal-library.fandom.com/wiki/Dromiciops_gliroides.
5.Nilsson, M.A., et al., Marsupial relationships and a timeline for marsupial radiation in South Gondwana. Gene, 2004. 340(2): p. 189-96.
6.Horovitz, I. and M.R. Sánchez-Villagra, A morphological analysis of marsupial mammal higher-level phylogenetic relationships. Cladistics, 2003. 19(3): p. 181-212.
7.Nilsson, M.A., et al., Tracking marsupial evolution using archaic genomic retroposon insertions. PLoS Biol, 2010. 8(7): p. e1000436.
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