连续4届诺奖得主都使用了这个方法……
分子互作是生命科学研究的基础手段之一，广泛应用于揭示分子机理、信号通路、调控机理、结构分析、蛋白质结构以及药物筛选等领域。Pull-down/IP、western等方法是传统的分子互作检测方法，但是操作繁琐，只能定性。而基于荧光的方法（比如荧光偏振）或者ELISA等方法，依赖对样品的标记，可能会改变物质本身的结构。
然而，有一种分子互作方法，连续4年的6位诺贝尔奖得主都在研究中使用了它！它就是来自于赛多利斯的Octet® 非标记分子互作系统！
这是一种非标记和实时的互作技术，基于生物层干涉（biolayer interferometry,BLI），并通过浸入即读的检测方式，只需几分钟就能获得结合速率常数、解离数据常数、平衡解离常数等信息，从而对分子互作进行更加定量化的表征，并于2021年写入美国药典。
美国药典[1]对这项技术的优点评价如下：
无需标记、高通量，能提供结合动力学和浓度测定数据，自动化程度相对高。
口说无凭，让我们用数据说话！
2020
诺贝尔生理学或医学奖
使用Octet® 做竞争实验
Charles Rice与其他两位杰出科学家因发现丙肝病毒而获得了诺贝尔生理学或医学奖。2020年，他在Nature杂志上发表了一篇文章[2]，主要研究新冠肺炎患者个体在恢复期内的新冠病毒血清抗体反应。研究发现，恢复期患者体内结合RBD（S蛋白的受体结合结构域）IgG抗体水平与NT50（50%最大病毒中和效价）密切相关。科研人员从康复患者的血液中分离出分泌与RBD结构域相结合的IgG的B细胞，并对其表达的抗体进行克隆表达，发现了具有强大中和病毒活性的RBD特异性抗体（编号为C144、C101、C121、C009、C135）。应用Octet® 进行表位分组实验，发现这些抗体可以识别不同的RBD表位。这些实验结果表明，针对S蛋白RBD结构域的疫苗应该具有很好的保护效果，为未来的疫苗设计指明了方向。
图1. Octet® 实验结果：（1）用Protein A传感器固化第一个抗体（Ab1），然后用无关IgG封闭；（2）依次结合RBD和第二个抗体（Ab2），通过响应信号的数值大小判别这些抗体是否结合不同的表位，比如：无论C135作为第一个抗体还是第二个抗体，其他抗体可以继续和RBD发生结合，说明C135识别的表位和其他抗体并不相同。
Octet® 可以通过非标记信号快速判定有没有结合
2020
诺贝尔化学奖
使用Octet® 做DNA和蛋白互作
Jennifer Doudna因发现CRISPR-Cas9基因编辑技术而获得了2020年诺贝尔化学奖，她的团队在Science Advances期刊上发表了一篇论文[3]，揭示了一种源自李斯特菌的抗CRISPR蛋白AcrIIA4，它能够阻断Cas9的活性，从而减少脱靶基因编辑所可能导致的不良副作用。
研究人员利用Octet® 分析了AcrIIA4对dCas9-sgRNA与靶标DNA结合的影响。实验结果表明，AcrIIA4浓度的增加与dCas9-sgRNA的结合信号呈负相关，这意味着AcrIIA4能够有效抑制靶点DNA和dCas9-sgRNA的结合。
图2.Octet® 数据：将生物素化的靶点DNA固定在链霉亲和素传感器上，然后与混入不同浓度的AcrIIA4的dCas9-sgRNA复合物进行结合解离实验。
相对EMSA等传统方法，Octet® 操作简单，可以灵活涉及直接结合或者竞争实验。
2021
诺贝尔生理学或医学奖
检测膜蛋白粗体物
David Julius因揭示触觉的分子机制获得2021年诺贝尔生理学或医学奖，他在2019年发表在《Cell》杂志上的一篇文章[4]，发现了一种来自于澳大利亚黑石毒蝎毒液的一种特异高效的TRPA1（一种离子通道）激动剂，并揭示了其作用机理。这种激动剂是一种被称之为“芥末受体毒素”（WaTx）的多肽。通过脂质体融合实验，发现WaTx能够深入细胞膜，与TRPA1的胞内段结合。结构解析发现，TRPA1胞内段存在可能与WaTx结合的口袋（包含P622位点）。Octet® 测试发现，P622位点突变体无法与WaTx结合，从而验证了结构解析的结果。
图3.Octet® 数据：SA（链霉亲和素）传感器固化Biotin-GSGS-WaTx，然后与表达人TRPA1细胞的膜提取物进行结合解离；野生型TRPA1有结合（左），而突变体无结合（右）
如果你觉得纯化蛋白过程繁琐，那就用Octet® 直接测粗样品吧！
2022
诺贝尔化学奖
检测药物与受体互作
2022年，诺贝尔化学奖颁发给了CR.Bertozzi等三位科学家，以表彰他们在"点击化学和生物正交化学"领域的卓越贡献。CR.Bertozzi课题组利用这种反应将唾液酸酶和一种抗体药物（曲妥珠单抗）偶联物形成一种新的免疫检查点抑制剂疗法，从而增强了抗癌免疫应答。这项研究结果发表在Nature子刊上[5]。抗体和Fc受体的结合活性是评价抗体药物的重要指标。本研究使用Octet® 发现，偶联后的抗体药物并未影响与Fc受体结合亲和力。
图4.用链霉亲和（SA）传感器固化生物素化的各种Fc受体，与100 nM的抗体或者抗体偶联物结合20 s，解离40 s；左右图分别为偶联前后的抗体
是的，没看错，1分钟就做完了结合解离，速度有多快！
2023
诺贝尔生理学或医学奖
测血清抗体亲和力
2023年，诺贝尔生理学或医学奖授予Drew Weissman和Katalin Karikó，以表彰他们在mRNA疫苗领域的卓越贡献。这两位诺贝尔奖获得者在2018年的一篇文章中使用Octet® 对疫苗诱导的血清中抗体的亲和力进行了测定[6]。随着接种时间的推移，产生的抗体亲和力逐渐提高。在接种疫苗后的2周，KD值（平衡解离常数）为362pM，而在4周时，这一数值更进一步降至6pM（KD值越小，亲和力越高）。那些接种未修饰的mRNA或灭活流感病毒颗粒的小鼠，其抗体亲和力远远不及HA mRNA疫苗接种小鼠。
图5.用AMC传感器（anti-mouse IgG）固化血清中的抗体，与31.25nM的HA进行结合解离，并用pH2.5的甘氨酸进行再生。左图为计算的KD值，纵坐标单位为 nM.右图为结合解离的原始数据，每个抗体7个浓度点
至少做了13个抗体，每个抗体7个浓度的测定，可见Octet® 的高通量！
Octet® 为什么那么受欢迎呢？
因为它用于亲和力验证的优点在于：
非标记Direct binding是趋势，不需要标记和信号放大，可以更好的保持反应物的活性。
快速测定亲和力，提供结合速率常数和解离速率常数更加定量化地表征分子互作。
无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快）;
写入了美国药典，文章>12000篇，认可度广;
万金油技术，可以用与检测DNA，小分子，蛋白质等各种生物分子
操作简便，耗材及维护成本低
还挣扎做传统分子互作方法的同学们，快去尝试Octet® 吧！
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-参考文献-
[1] 美国药典2021版〈1108〉 ASSAYS TO EVALUATE FRAGMENT CRYSTALLIZABLE (FC)-MEDIATED EFFECTOR FUNCTION
[2] Vogel AB, et al. BNT162b vaccines protect rhesus macaques from SARS-CoV-2. Nature. 2021 Apr;592(7853):283-289.
[3] Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic. Science Advances, 12 Jul 2017
[4] A Cell-Penetrating Scorpion Toxin Enables Mode-Specific Modulation of TRPA1 and Pain.Cell,2019
[5] Carolyn R. Bertozzi et al.Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo.Nature Chemical Biology volume 16, pages1376–1384 (2020)
[6] Nucleoside-modified mRNA vaccines induce potent Tfollicular helper and germinal center B cell responses. J. Exp. Med. 2018 Vol. 215 No. 6 1571–1588
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