诺奖花落mRNA疗法，NanoFCM赋能核酸药物研究

凭借研发周期短和大规模、低成本、灵活性生产等优势，mRNA创新疫苗在疫情抗击中一战成名，挽救了数百万人的生命，有效地降低了COVID-19对公共安全造成的影响。据Clinical Trials统计，除了COVID-19疫苗研究以外，已有200+项针对mRNA研究处于临床研究或招募志愿者阶段。2023年10月2日，诺奖委员会宣布将2023年诺贝尔生理学或医学奖授予塔林·卡里科(Katalin Karikó)和德鲁·维斯曼(Drew Weissman)，表彰两位在核苷酸基修饰的杰出贡献，从而开发出有效的COVID-19 mRNA疫苗。随着诺奖花落mRNA疗法以及多家mRNA疫苗相关的产品获批，相信未来mRNA技术还能为我们带来更多的惊喜。

图1.诺贝尔生理学或医学奖（来源：诺奖委员会官网）

mRNA疗法之所以能在新冠疫苗中大放异彩，离不开递送系统研究领域打下的坚实基础，一个理想的递送系统需要具备解决细胞外屏障、内体逃逸和细胞内免疫等难点的能力。目前，学术界和工业界开发了多种用于mRNA递送的材料，如脂质纳米颗粒(LNPs)、脂质体、脂质复合物、外泌体等，其中，LNPs的应用最为广泛。

mRNA-LNP制剂的生物分布、递送效率和免疫反应会受其样本的尺寸、分散性、包封率、空壳率以及体系中游离核酸等诸多因素的影响。粒径大小是决定纳米药物的半衰期和在体内分布的关键参数，粒径较小的纳米药物更可能会逃脱吞噬细胞的摄取，而颗粒浓度则直接影响产品的给药剂量和治疗效果。LNPs的一种核心成分阳离子脂质具有一定的细胞毒性，会导致细胞膜损伤，在治疗过程中可能引发不必要的毒副作用，为了降低纳米药物的毒副作用，在成产和下游工艺过程应控制空壳LNP比例，尽可能让每个颗粒都实现药物的有效装载，并且需确保药物包裹在颗粒内部而非吸附于表面。中国药物评价中心(CDE)和美国食品和药物监督管理局(FDA)的指南均要求对纳米尺度药物产品进行综合的表征。目前，在LNP制剂的相关研究中多以宏观的药物包封率量化，而关于mRNA在单个LNP中的载量、分布、以及空载的LNP含量等关键指标的分析却鲜少报导。

受限于此前没有直接定量的方法，常用RiboGreen定量检测mRNA的含量从而计算包封率，该方法需要先检测游离的RNA，然后用Triton进行充分裂解，释放内部的RNA，分析总的mRNA含量，通过差值计算包裹在载体内的mRNA数量，从而得到包封率的结果。但该方法仍是一种间接的检测方法，无法获悉每个LNP颗粒是否载有mRNA分子以及载量分布情况。

此外，常用的方法如电镜(TEM)、小角中子散射(SANS)、小角X射线散射(SAXS)、纳米颗粒追踪技术(NTA)等方法聚焦在粒径、形貌等物理指标的检测，无法有效区分载mRNA-LNP和empty-LNP，更不用说mRNA的载量和定位分析了。

有研究通过采用非对称流场流分离(AF4)测量技术与SAXS的技术联用策略实现纳米颗粒的定量、绝对尺寸分布曲线，再依靠该分析方法进一步计算得到mRNA-LNP浓度，mRNA拷贝数等指标结果，但此类方法仍是一种基于整体检测进行计算的Bulk方法，无法从根本上解决由于颗粒异质性造成结果偏差的问题，且难以匹配实际生产过程中快速检测的需求。

此前，也有文章指出超过50%的LNPs没有成功装载mRNA，而在包装了mRNA的LNPs中，大部分颗粒中仅有2-3个mRNA分子，该结果一经发表，引起了行业内的广泛热议，相信大多数mRNA企业是不愿意接受这个结果的。人们期待这类单颗粒水平精确检测及分析mRNA-LNP制剂的不同组分含量、mRNA拷贝数的方法快速实现商品化。殊不知，早在2017年NanoFCM就实现了这类技术的商品化，且在2022年率先发布了核酸药物方向的解决方案。

由厦门福流生物公司开发并进行商品化的纳米流式检测仪，提供了单颗粒、多参数综合表征的技术平台，基于平台的高灵敏散射检测和荧光标记策略，可用于单个LNP中mRNA载量、分布、以及empty-LNP含量的快速、高通量分析。全球诸多核酸药物、外泌体领域顶级研究机构和高科技企业已成为该产品的忠实用户，持续证明了纳米流式检测技术在单颗粒表征方面的显著优势。

图2. 纳米流式在mRNA-LNP中的多维应用

如下图3所示，基于纳米流式卓越的散射检测灵敏和分辨率，可快速获得mRNA-LNP粒径、粒径分布和浓度结果。

图3. (左)mRNA-LNP的粒径和浓度分析 (右)mRNA-LNP的浓度梯度稀释曲线

NanoFCM具有卓越的散射光和荧光检测灵敏度，散射光信号触发可实现鉴定和指认所有的脂质纳米颗粒，进一步通过核酸染色实现空壳率和装载效率的的评估。

利用跨膜核酸染料标记内部包裹的mRNA，即可快速判定药物空壳率。如下图4所示，在不同工艺条件下，mRNA-LNP的空壳率存在差异。其中，P1(满壳率)表示装载有mRNA的LNPs比例，P2 (空壳率)为未装载mRNA的LNPs比例。需要注意的是，满壳率≠包封率。

图4. LNPs空壳率/满壳率检测

经跨膜核酸染料标记，在荧光通道观察到部分游离的RNA分子产生的信号和载了RNA的颗粒信号，荧光强度与核酸分子的拷贝数成线性正相关关系，可快速获得LNP拷贝数定量和分布结果。下图5所示每个LNP包裹mRNA的拷贝数分布较广泛，从单拷贝到几十个不等，中位值为3.3个。

图5.mRNA拷贝数分析

可采用纳米流式按下图6所示标记策略对mRNA-LNP进行核酸定位分析，进而优化合成方法和下游工艺流程，尽可能最大化地实现mRNA的有效装载，获得高纯度、高装载效率的mRNA-LNP产品。

图6. LNP-mRNA组分鉴定策略

当然，机遇与挑战并存，下一代纳米药物的开发过程也将面临重重挑战，如提高药物稳定性和多功能化、靶向修饰等。纳米流式具备高通量、低消耗量、快速检测的特性，在未来mRNA技术的研发、生产过程和质量控制中，可以为监管单位、制药企业及基础研究单位提供一个高效、可靠且灵活的检测手段。

为了更好的助力mRNA新药研发和产业化，本期e课堂有幸邀请到Ben Peacock博士带来“Assessment of mRNA Payload Distribution and Capacity of LNPs by Nano-Flow Cytometry”主题报告，将重点围绕如何使用纳米流式单颗粒表征平台对mRNA-LNP粒径、浓度、空壳率/满壳率及mRNA拷贝数等指标进行快速、多参数检测，展示检测数据及分析结果，就如何提升LNP制剂开发、实现核酸拷贝数定量分析以及空壳率检测等大家广泛关注的热点话题展开讨论。报告中也会介绍如何通过NanoFCM的快速表征结果优化上游的参数和条件，从而提高终产品的纯度和产率，这种创新稳健的技术手段将有望广泛应用于mRNA-LNP的工艺优化、大规模生产、质量控制、稳定性评估等过程，欢迎您扫码参会！

更多详情，欢迎致电18150361037（微信同号）或联系[email protected]咨询。

• João Conde, Robert Langer, José Rueff. mRNA therapy at the convergence of genetics and nanomedicine[J]. Nature Nanotechnology, 2023, 18: 537–540.

• MelissaA. Graewert, Christoph Wilhelmy, Tijana Bacic, et al. Quantitative size-resolved characterization of mRNA nanoparticles by in-line coupling of asymmetrical-flow field-flow fractionation with small angle X-ray scattering[J]. Scientific Reports, 2023, 13:15764. 

• Sixuan Li, Yizong Hu, Andrew Li,et al. Payload distribution and capacity of mRNA lipid nanoparticles[J]. Nature Communications, 2022, 13:5561.