武汉理工官建国团队Sci.Adv.：可注射纳米机器人载药靶向溶栓

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随着微纳米制造技术的不断提高，微纳机器人（MNRs）获得了快速的发展。其中，磁驱MNRs集群的驱动力大、操控性强等，在快速溶栓方面显示出巨大的潜力；但是它们在血液环境中工作时由于组成单元粒子个体间的排斥力弱，极易在血管中发生严重的聚集和生物粘附等现象。这一局限性使其在临床溶栓应用中产生诸如脱靶毒性、毛细血管堵塞和外源性刺激带来二次血栓等重大风险和严重的副作用，从而严重制约MNRs在溶栓方面的临床应用。

基于此，武汉理工大学官建国教授团队发展了一种通过在磁性粒子表面修饰类肝素分子刷（PSS）的磁性纳米粒子（MB@PSS）。它们能通过静脉注射进入血管，通过血液循环输送、磁富集到血栓位置前端，然后在交变磁场作用下组装成纳米机器人（HPB-NRs）集群，导航运动到血栓位置，通过运动靶向药物溶解和机械力的协同作用实现安全高效溶栓。该PSS分子刷修饰策略，赋予HPB-NRs集群在高离子强度血液环境中能表现出可逆组装、低溶血、抗生物粘附和自抗凝性能；同时，可以在体外/体内血栓模型中表现出“运动靶向”递药-机械力高效协同溶栓行为；以及在完成溶栓和撤除磁场后，HPB-NRs集群在血液中还可自动分散成单个的MB@PSS，不会出现明显的器官损伤或炎症反应。

在《Science Advances》期刊首页上的Feature Image介绍

研究成果以“Swarming magnetic nanorobots bio-interfaced by heparinoid-polymer brushes for in vivo safe synergistic thrombolysis”为题刊登在Science子刊Science Advances上，并且被期刊网站首页以“Injectable nanobots deliver drugs for targeted therapies”作为Featured image加以推介。武汉理工大学博士生杨满义为第一作者，武汉科技大学硕士生张耀宇为共同第一作者，武汉理工大学官建国教授、牟方志研究员、和中部战区总医院李智主任医师为共同通讯作者，武汉理工大学材料复合新技术国家重点实验室为第一通讯单位。

图1. MB@PSS纳米粒子的结构和在交变磁场下组装形成HPB-NRs集群的靶向溶栓示意图

HPB-NRs纳米机器人的构筑单元MB@PSS（图1-A）由磁性纳米粒子在表面修饰类肝素分子刷（PSS）构成（图1-B）。通过表面类肝素分子刷修饰，赋予MB@PSS高密度的表面负电荷，这为MB@PSS通过静电作用负载溶栓药物（t-PA）提供了丰富的结合位点（图1-C）。同时，由于表面功能化的磺酸基团对抗凝血酶因子AT III具有良好的结合能力，MB@PSS表现出自抗凝能力（图1-D）。由于它们与血液环境中的红细胞（RBC）和血管内皮细胞（VECs）具有强烈的静电排斥作用，从而表现出低溶血和强抗生物粘附（图1-E）。

基于以上优势，作者提出了用磁性纳米粒子MB@PSS构建纳米机器人集群的 “五步溶栓”策略（图1-F）：1、静脉注射MB@PSS的生理盐水分散液到血管中（step-i）；2、在血栓部位的上游分支血管表皮处放置永磁体，收集通过血液循环系统输送到此的MB@PSS粒子（step-ii）；3、收集到的MB@PSS在进动磁场作用下组装成HPB-NRs纳米机器人集群靶向导航到达血栓部位（step-iii）；4、将控制磁场调制为旋转磁场，诱导HPB-NRs集群对血栓产生机械力和溶栓药物的协同作用实现高效溶栓（step-iv）；5、血栓被打通后撤掉交变磁场，纳米机器人集群自动分散为单个MB@PSS纳米粒子。

图2. MB@PSS纳米粒子的表征，在高离子强度溶液中的分散原理，以及在生物介质DMEM和全血中的分散性

类肝素分子刷（PSS）修饰的磁性纳米粒子MB@PSS是通过表面原子转移自由基聚合（ATRP）方法制备得到。得益于强电离PSS分子刷在不同pH环境下的稳定性，它们在生物介质溶液中具有高度分散性（图2-D、E），能在DMEM培养基中自动分散成单个纳米粒子（图2-F）。即使是团聚状态的MB@PSS纳米粒子加入到全血中也同样会自动分散为单个的纳米粒子（图2-G）。

图3. HPB-NRs集群在交变磁场下的运动特性

分散在生物液体介质中的MB@PSS纳米粒子在施加进动或旋转磁场B(t)时，会在静电斥力（F₁）、范德华力（F₂）和磁偶极-偶极吸引力（F₃）的平衡作用下组装形成摆动或旋转的棒状HPB-NRs，并做摆动和旋转的靶向运动（图3-A）。一旦撤掉外加磁场，HPB-NRs纳米机器人又可逆转变成单个分散的MB@PSS粒子。（图3-B-E）。HPB-NRs纳米机器人可以在血管内皮细胞上运动，而且几乎不会出现粘附在血管内皮细胞表面的现象（图3-F）。

图4. HPB-NRs纳米机器人集群的体外溶栓

作者建立了体外模型，探究了t-PA负载的HPB-NRs集群在体外条件下对血栓的靶向，以及溶栓能力。通过图4-A的微流控芯片可视化HPB-NRs集群溶栓过程。在磁场驱动下，负载t-PA的HPB-NRs集群以皮划艇式的“爬行”运动模式通过微通道，然后以“滚动”运动模式与血栓发生机械作用，并随时间延长，逐渐进入血栓（图4-A）。在微流体通道和大体积的血栓模型中，HPB-NRs在机械力和靶向溶栓药物的协同作用下表现出快速溶栓能力（图B-E）。这主要是因为旋转的HPB-NRs集群能对血栓块能产生机械力破坏作用，进入血栓内部并增加t-PA在该区域的浓度，从而促进t-PA更有效地溶栓。

图5. HPB-NRs纳米机器人集群的体内溶栓

作者搭建了如图5-A所示的小动物溶栓平台，通过仰卧位将大鼠送入三维线圈中进行溶栓治疗。对股静脉血栓模型（图5-B）大鼠注射MB@PSS纳米粒子，用超声成像法能观察到注射的MB@PSS纳米粒子在磁场作用下实现了在血栓前端的高效富集（图5-C）。图5-D表明：对照组由于血栓堵塞，血液淤积继续降低了股静脉的血流信号，导致整个区域在4 h后基本无血流。NRs+B(t)和游离t-PA药物组在治疗4 h后血流信号仅略有增加。NRs+t-PA组由于t-PA靶向递送，治疗4 h后血流信号明显增强，在2 h时从激光散斑血流成像图中可以看到有明显的血流灌注恢复。通过定量分析图5-E中的相对血流信号可知，NRs+t-PA+B(t) 组的血流量增量最大，高于NRs+B(t)组和NRs+t-PA组的血流量之和，证实了HPB-NRs集群在体内溶栓也表现出机械力破坏和溶栓药物t-PA的协同作用。残余血栓组织切片结果如图5-F，在4 h治疗后，NRs+t-PA+B(t)组基本无残留血栓存在。该结果证实了HPB-NRs集群可以实现在体内的高效靶向溶栓。

图6. 纳米机器人的体内安全性研究

作者评估了HPB-NRs纳米机器人的构筑单元（MB@PSS NPs）的生物安全性。如图6-A，血生化检测结果显示MB@PSS 纳米粒子无肝、肾毒性。相比之下，裸露（未修饰，不含PSS刷）的MBs的大鼠在14天后TBIL略有升高，表明有一定的肝损伤。此外，收集MBs和MB@PSS 纳米粒子尾静脉注射大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的组织进行H&E染色，如图6-B所示。结果表明无论是短期（2天）还是长期（14天），均未出现明显的器官损伤或炎性病变，证明MB@PSS 纳米粒子可以在体内执行安全的溶栓任务。如图6-C，在大鼠体内注射了MBs和MB@PSS纳米粒子的14天后研究发现，MBs和MB@PSS纳米粒子主要存在于肝脏和脾脏。其中MBs纳米粒子主要以聚集体形式存在，难以被免疫细胞吞噬，暗示其长期存在可能会对这些器官造成损害；而MB@PSS 纳米粒子以分散状态存在于这些器官中，并被免疫细胞吞噬。这说明表面修饰类肝素PSS刷对MB@PSS 纳米粒子在血液环境中具有良好的分散性，能显著提升其生物安全性。

本工作发展了一种磁性纳米机器人集群组成单元表面修饰类肝素分子刷（PSS）的界面设计制备策略和在体内进行高效安全溶栓的治疗策略。MB@PSS纳米粒子表面的PSS分子刷可以赋予纳米机器人高的表面电荷；随着介质中离子浓度（NaCl）的增加，分子刷层收缩，并进一步增加表面电位。MB@PSS纳米粒子与血液相容，溶血率低（＜5%）和抗生物粘附能力强，能在交变磁场下可逆组装成磁驱纳米机器人集群，在静脉注射进入体内能避免继发性血栓形成的风险。体外和体内实验证实，HPB-NRs集群可以通过协同“运动靶向”给药和机械破坏进行安全高效的溶栓，负载t-PA的HPB-NRs可以在4 h内疏通大鼠股静脉血栓。该HPB-NRs集群也可望用于治疗更具有挑战性的血栓性疾病，如脑卒中和肺栓塞。此外，它们还可以作为一个通用的靶向治疗递送平台，促进基于运动的磁驱MNRs集群在生物医学应用方面的发展。

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