Adv Sci丨王瑞兵教授团队设计细胞仿生纳米药物搭细菌便车用于增强肿瘤铁死亡和免疫治疗

铁死亡（Ferroptosis ）是一种铁依赖性的区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型细胞程序性死亡方式。铁死亡的主要机制是在铁离子作用下催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，降低胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达，从而诱导细胞死亡。考虑到铁在铁死亡中的关键作用，各种铁死亡诱导剂，如铁氧醇、磁性纳米颗粒（Fe₃O₄）、铁有机框架化合物和二茂铁等已被用于铁死亡相关的癌症治疗研究。然而，温和的免疫原性、较低的肿瘤靶向性和较差的组织穿透性限制了其治疗效果。

一方面，癌细胞膜具有天然的免疫逃逸和对肿瘤的内在归巢特性，癌细胞仿生纳米药物不但可有效降低药物载体的免疫原性还可提高药物载体的循环稳定性和肿瘤靶向性。另一方面，肿瘤内部的厌氧环境，富营养化和免疫抑制微环境，可趋使细菌在肿瘤部位富集定殖，激活先天性免疫细胞和释放促炎因子，不但可诱导抗肿瘤免疫反应，还可导致肿瘤血管的破坏和相关栓塞的形成，抑制肿瘤生长。使用细菌作为递送载体可以改善药物在肿瘤中的积累和渗透，从而提高其治疗效果。

最近，澳门大学王瑞兵教授等人提出了“超分子工程化细菌”策略，将超分子主体修饰的细菌与超分子客体修饰的癌细胞仿生的Fe₃O₄通过主客体作用相结合，构建细菌-Fe₃O₄超分子偶联物，利用细菌和癌细胞膜的双重肿瘤富集靶向性，增强细菌-Fe₃O₄超分子偶联物对肿瘤组织的靶向定植，将细菌免疫治疗与Fe死亡结合，实现肿瘤的高效、精准、低副作用治疗。相关工作以 Supramolecularly Engineered Conjugate of Bacteria and Cell Membrane-Coated Magnetic Nanoparticles for Enhanced Ferroptosis and Immunotherapy of Tumors 为题发表在Advanced Science上。

在本项研究中，作者选择安全性高、抗癌活性强、肿瘤靶向能力优异的減毒的兼性厌氧鼠伤寒沙门氏菌VNP20009（VNP）作为细菌模型，选用乳腺癌细胞（4T1）作为癌细胞模型；将超分子主体（葫芦【7】脲, CB【7】）和客体（金刚烷，ADA）通过简单的脂质体插膜分别偶联到VNP和4T1表面。再将ADA修饰的4T1细胞膜（CM-ADA）修饰到载有铁死亡诱导剂（柳氮磺胺吡啶，SAS）的Fe₃O₄（FeA）表面（FeAM）。CB【7】修饰的VNP（VNP-CB【7】）和FeAM可通过CB【7】和ADA之间的强主客体相互作用结合，从而获得VNP-Fe₃O₄超分子偶联物（FeAMV），并用于细菌搭便车的药物递送（图1A）。

图1. FeAMV构建以及诱导癌细胞铁死亡示意图

静脉注射后，得益于VNP和CM的优异肿瘤靶向特性，FeAMV可在肿瘤部位特异性累积，FeAMV被肿瘤细胞内吞后，CM在跨膜运输内吞中被破坏，从而暴露出FeA，从FeA释放出的SAS通过抑制GPX4-胱氨酸反转运系统中Xc转运蛋白（XcT）的表达来抑制半胱氨酸的摄取，抑制细胞合成GSH，从而诱导铁死亡。Fe₃O₄可与SAS协同作用，通过Fenton反应引发铁死亡，抑制肿瘤生长。铁死亡的发生还可诱导肿瘤组织中树突状细胞（DC）的成熟和巨噬细胞的M1极化，实现免疫治疗。此外，VNP在肿瘤部位的定殖也可促进巨噬细胞M1极化，不仅可提高细胞内H₂O₂水平，还可诱导适应性免疫反应，促进肿瘤铁死亡和免疫反应（图1B）。因此，FeAMV可实现细菌的免疫治疗与铁死亡相互结合和增强，提高抗肿瘤效果。

CLSM结果表明CB[7]和ADA在VNP以及CM上均具有很好的插膜稳定性。Fe₃O₄在VNP上均匀修饰且具有优异稳定性。SAS在FeM上具有高达20.1%的负载率且具有pH相关的释放特性。FeA结合了SAS和Fe₃O₄的协同诱导癌细胞铁死亡作用，因此，比SAS和Fe₃O₄对4T1细胞具有更高的死亡率。自身具有一定抗癌效果的VNP结合FeA后抗癌效果显著增加。凋亡抑制剂（FMK）、坏死抑制剂（NEC）和抑制剂（3-MA）的加入对于FeMV处理的4T1细胞死亡率几乎没有影响，而铁死亡抑制剂（Fer-1）和铁螯合剂（DFO）的加入显著增加了FeAMV对4T1细胞的死亡率，由此可确定FeAMV诱导的铁死亡导致了癌细胞的死亡。由于铁死亡是基于Fenton反应诱导的GSH相关的活性氧（ROS）过量产生和积累，因此，通过ROS探针（DCFH-DA）评价FeAMV对4T1细胞ROS水平的影响来进一步验证铁死亡机制。实验结果表明4T1细胞ROS的量与FeAMV的加入量成正相关，且加入Fer-1和DFO后，ROS量显著降低。随着FeAMV量的增加，4T1细胞产生的GSH的量线性降低，而加入Fer-1和DFO后，GSH量显著增加，进一步验证了铁死亡机制。得益于VNP和CM的双重肿瘤靶向性，生物分布结果表明FeMV相对于VNP、FeM、Fe₃O₄组在肿瘤部位具有更多的Fe₃O₄和VNP聚集量。

作为抗原呈递细胞，DC参与维持T细胞介导的免疫反应，产生的抗原因子可促进未成熟DC（iDC）的成熟。应用流式细胞仪分析FeAMV对DC成熟的影响，通过比较4T1细胞处理前后的CD11c⁺中CD86⁺的比例来评价细胞成熟水平，验证免疫激活效应 。与Fe₃O₄和SAS组相比，FeA和VNP组的CD11c⁺中CD86⁺的比例均显著增加，表明铁死亡和VNP均可诱导DC的免疫激活并触发其有效成熟。铁死亡和VNP可协同诱导免疫激活，FeAMV组中的CD11c⁺与CD86⁺比例最大。肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）是DC启动相关的细胞因子，通过对比巨噬细胞（Raw264.7）与FeMV共孵育前后TNF-α和IL-6表达量的差异，进一步评价免疫激活反应。在所有组中，与FeAMV共培养的Raw264.7细胞产生的IL-6和TNF-α的量最大，与DC成熟水平一致。

小鼠的存活率、体重变化、肿瘤体积、病理组织切片等系列结果表明，FeAMV相对于其他研究小组具有最优异的抗肿瘤疗效。通过检测肿瘤和血清中代表性免疫细胞因子TNF-α和IL-6的表达水平进一步评估各种制剂诱导的体内免疫反应。PBS和SAS组小鼠中的TNF-α和IL-6的过表达几乎可以忽略不计，而由于铁死亡的发生，FeA可以促进TNF-α和IL-6的表达。由于CM可增强药物载体的渗透性和靶向性，与FeA组相比，FeAM组表现出更高的TNF-α和IL-6表达量。具有独特靶向特性的VNP可诱导肿瘤的免疫反应，导致TNF-α和IL-6的表达上调。免疫细胞因子分析和肿瘤组织免疫染色均证实，FeAMV组在所有测试组中表现出最高TNF-α和IL-6的表达量。考虑到免疫反应可以促进抗炎巨噬细胞（M2）向促炎巨噬细胞（M1）的极化。因此，通过分析CD11c（M1标记物）和CD206（M2标记物）的比率来评估M1/M2的比例，以进一步分析免疫系统激活。研究结果表明，FeAMV处理的小鼠表现出最大的M1/M2比例。

所有小鼠主要器官切片的HE染色分析显示，所有制剂对器官产生可忽略不计的毒性。天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和谷氨酰转肽酶（GGT）是肝脏炎症损伤的标志物。乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）是心脏炎症损伤的指标。尿素（Urea）和肌酸酐（CREA）是肾脏炎症损伤的指标。血液学分析显示，用FeAMV治疗的小鼠的AST、ALT、GGT、LDH、CK、UREA和CREA值均在正常范围内，表明FeAMV具有优异安全性，不会对心脏、肝脏和肾脏造成损伤。

综上所示，本工作提出的“超分子工程化细菌”策略，可解决目前细菌在抗肿瘤应用中存在的细菌表面修饰步骤繁琐且易损细菌生物活性、副作用强、靶向性差、效果不佳等问题，将超分子主体修饰的细菌与超分子客体修饰的细胞膜仿生的Fe₃O₄通过主客体作用相结合，构建细菌-铁死亡载体超分子偶联物，利用细菌和细胞膜的双重靶向性，增强细菌-铁死亡那个载体超分子偶联物对肿瘤组织的靶向性，将细菌免疫治疗与铁死亡相结合并实现相互放大和增强，实现了肿瘤的高效、精准、低副作用治疗。本工作不仅为将细菌作为稳定的靶向药物载体提供了一种新的超分子方法，还为肿瘤的特异性和高效治疗提供了新的思路。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202304407

来源：BioArtMED

   

小编微信

注：添加小编请备注昵称+单位+研究

生命科学综合交流QQ群:681341860

微信学科群：病毒学群，神经科学群、临床医学、肿瘤学科群、硕博交流群和医药投资交流群（微信群审核要求较高，请各位添加小编后主动备注单位研究方向）