Nature子刊 | 清华大学孙前文实验室揭示DNA引物酶促进转录复制间的竞争并影响基因组稳定性的新机制

转录和复制是生物体维持和传递遗传信息的重要事件，它们以同一套基因组为模板，因而常会发生转录-复制对撞，诱发R-loop积累和DNA断裂，导致基因组损伤。R-loop是由杂合双链RNA:DNA和单链DNA组成的三链核酸结构，其过量积累会导致基因组不稳定，因此生物体进化出了一系列机制调控基因组内R-loop的水平。其中核糖核酸酶RNase H能够特异消化RNA:DNA杂合链中的RNA，从而清除R-loop，维持基因组稳定。

2024年1月2日，清华大学生命学院孙前文实验室在《自然·通讯》(Nature Communications)杂志上发表了题为“引物酶促进转录和复制在同一模板链上的竞争从而导致DNA损伤” (Primase promotes the competition between transcription and replication on the same template strand resulting in DNA damage)的研究论文。该研究揭示了拟南芥叶绿体DNA复制引物酶促进叶绿体基因组的转录复制竞争和R-loop积累，从而诱发叶绿体基因组断裂的分子机制。

▲孙前文实验室在《自然·通讯》(Nature Communications)杂志发表论文

叶绿体是植物进行光合作用的场所，孙前文实验室前期鉴定了拟南芥基因组编码的三个RNase H1蛋白，并发现定位于叶绿体的AtRNH1C蛋白可以与DNA Gyrase（拓扑异构酶）互作解除叶绿体基因组的转录复制对撞，清除R-loop，减少DNA的损伤。atrnh1c突变体的叶绿体基因组内R-loop过量积累，高转录复制对撞区域DNA断裂增多，从而引发叶片黄化，植物矮小的表型（Yang et al., The Plant Cell 2017）。

为进一步探究参与基因组稳定性和R-loop调控的新因子，孙前文实验室对atrnh1c突变体进行EMS诱变筛选，获得多个表型抑制突变体。其中acs1（atrnh1c suppressor 1）突变体无论是叶片颜色，光合效率，以及叶绿体的数目和形态，与atrnh1c相比均有显著恢复（图1a和b）。通过基因定位和功能验证鉴定到ACS1基因编码一个叶绿体和线粒体双向定位的引物酶ATH（图1c-f）。引物酶在DNA复制过程中合成小的RNA片段，引导合成新的DNA链。

▲ 图1 叶绿体引物酶ATH点突变通过减弱其与DNA结合抑制atrnh1c突变体表型

在acs1突变体中，ATH蛋白的一个跨物种间高度保守的氨基酸发生替换，导致蛋白与DNA模板的结合能力变弱，合成RNA引物以及介导DNA复制酶合成DNA的能力下降，从而减缓了转录-复制对撞和R-loop积累，使得atrnh1c突变体的表型缺陷发生一定程度的恢复（图2a-c）。通过链特异性的DNA断裂测序发现，在叶绿体基因组中高转录复制对撞的rDNA区域，转录和后随链的复制在同一条DNA链上进行，这条链的转录本末端存在特异且较高程度的单链DNA断裂（图2d和e）。通过构建叶绿体DNA复制酶Pol1A与AtRNH1C的双突材料1cpol1a，进一步验证了减缓复制可以减轻转录-复制对撞和R-loop积累，从而维持基因组稳定，恢复atrnh1c突变表型。

▲图2 ATH点突变减少叶绿体基因组R-loop积累和转录-复制冲突

此外，作者发现超表达引物酶ATH会促进叶绿体基因组中R-loop过量积累，诱发DNA断裂，并引起植株产生新叶黄化的表型（图3 a和b）；而通过基因编辑敲除ATH则会导致胚胎致死，胚胎发育停滞在球形胚期（图3 c-f）。这些结果表明细胞器中的引物酶ATH对于拟南芥的正常生长发育不可或缺。

▲图3 适当的ATH表达对于植物正常生长发育具有重要意义

综上，本研究通过筛选拟南芥叶绿体中高度积累R-loop的atrnh1c突变体的回复突变，揭示了引物酶在调控基因组转录复制对撞中的作用，对于研究其他物种中的R-loop和基因组稳定性的调控机制具有借鉴意义。同时，本研究也证实了拟南芥细胞器引物酶ATH的适当表达水平对于植物的生长发育的重要性。

清华大学生命科学学院博士后张卫峰为该论文第一作者，孙前文副教授为本文通讯作者，孙前文实验室2016级已毕业博士生杨卓和已出站博士后王文杰也参与了该项研究。该工作得到国家自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心、中国博士后科学基金等经费的支持。

原文链接 ：https://www.nature.com/articles/s41467-023-44443-0#Ack1