蛋白胶的问题请教一下# Biology - 生物学
x*9
1 楼
请问大家，我用case number 从http://j1visawaiverstatus.state.gov查询，显示3月4号DOS收到NOL, 到现在还没有更新。请问多久才显示DOS向USCIS发出Recommendation信息。谢谢。
i*t
2 楼
【 以下文字转载自 Visa 讨论区 】
发信人: intelbot (WORM), 信区: Visa
标 题: 问个H4的问题
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Sep 6 23:18:00 2010, 美东)
我现在是H1B renew中，估计要在年底批准。
领导已经有了一张h4的visa，明天8月份才过期，但是标注上写着我的现在h1b的过期时
间。
我领导10月份要回去一次，她是不是要等我的renew批准了才能来美国。
他是否可以不用去大使签证，直接用我的renew的h1b批准件和现在的h4 visa进入美国？
发信人: intelbot (WORM), 信区: Visa
标 题: 问个H4的问题
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Sep 6 23:18:00 2010, 美东)
我现在是H1B renew中，估计要在年底批准。
领导已经有了一张h4的visa，明天8月份才过期，但是标注上写着我的现在h1b的过期时
间。
我领导10月份要回去一次，她是不是要等我的renew批准了才能来美国。
他是否可以不用去大使签证，直接用我的renew的h1b批准件和现在的h4 visa进入美国？
z*h
3 楼
我有个比较棘手的问题，想请问各位大牛。
我去年毕业了，OPT一年，今年夏天OPT结束后在一个语言学校挂了F1身份，最近找到工
作了，目前谈的明年一月份报道上班，但是听说今年H1名额已经没了，我OPT也用完了
，我在语言学校可以CPT么？
或者谁知道什么语言学校可以挂F1，不去上课，能CPT的？
哪位高人帮帮我，私信也可以！
我去年毕业了，OPT一年，今年夏天OPT结束后在一个语言学校挂了F1身份，最近找到工
作了，目前谈的明年一月份报道上班，但是听说今年H1名额已经没了，我OPT也用完了
，我在语言学校可以CPT么？
或者谁知道什么语言学校可以挂F1，不去上课，能CPT的？
哪位高人帮帮我，私信也可以！
t*e
4 楼
光算Base的话，Contractor Position 是Permannent Position的多少才值得考虑？
2倍，3倍，4倍？
2倍，3倍，4倍？
s*g
5 楼
阴天conservatory里面拍的，Velvia 50在低色温条件下的表达还是挺有意思的。
120MP这个头还是挺不错的，除了不是真微距。拍了拍人（老婆），觉得做人像头也很
好，比较灵活的一个头。
120MP这个头还是挺不错的，除了不是真微距。拍了拍人（老婆），觉得做人像头也很
好，比较灵活的一个头。
i*k
6 楼
让baby给送走了。果然还是不能跟这群人搞好关系啊。迫于压力或者之前女主的光环就
这么给挤走了。
我个人还是对迪丽热巴还算有那么点好感，尤其是发展新CP啊，迪丽热巴和鹿晗还能发
展一下。不过我看网上吃的最热的还是郑凯和baby呼声一片啊，看来baby也是宋智孝那
种类型了。不知道是可喜可贺还是应该说是固定出演了所以来了谁都得被换掉？
不过这也好。给迪丽热巴一个综艺开始的道路，在这个国人喜欢的节目里还能涨涨粉，
多一点点的机会给新人吧。
不过我看这卫视们一个个的节目可快了。搞不好就是迪丽热巴的年代了。主要长得好素
颜也可以比baby好。这要的妹子以后要上位也快啊。
但是跑男这个节目越来越没意思了是真的。真的再看都是爱或者对这个节目有情怀的人
了吧。
这么给挤走了。
我个人还是对迪丽热巴还算有那么点好感，尤其是发展新CP啊，迪丽热巴和鹿晗还能发
展一下。不过我看网上吃的最热的还是郑凯和baby呼声一片啊，看来baby也是宋智孝那
种类型了。不知道是可喜可贺还是应该说是固定出演了所以来了谁都得被换掉？
不过这也好。给迪丽热巴一个综艺开始的道路，在这个国人喜欢的节目里还能涨涨粉，
多一点点的机会给新人吧。
不过我看这卫视们一个个的节目可快了。搞不好就是迪丽热巴的年代了。主要长得好素
颜也可以比baby好。这要的妹子以后要上位也快啊。
但是跑男这个节目越来越没意思了是真的。真的再看都是爱或者对这个节目有情怀的人
了吧。
p*i
7 楼
1. stacking gel 应该多长，由那些因素决定?
2. 除了蛋白的量过大外，有什么其他因素会导致类似于overload的现象?
谢谢
2. 除了蛋白的量过大外，有什么其他因素会导致类似于overload的现象?
谢谢
s*u
8 楼
取决于具体的 VO until he(she) processed your case and approved your case.
【在 x****9 的大作中提到】
: 请问大家，我用case number 从http://j1visawaiverstatus.state.gov查询，显示3月4号DOS收到NOL, 到现在还没有更新。请问多久才显示DOS向USCIS发出Recommendation信息。谢谢。
【在 x****9 的大作中提到】
: 请问大家，我用case number 从http://j1visawaiverstatus.state.gov查询，显示3月4号DOS收到NOL, 到现在还没有更新。请问多久才显示DOS向USCIS发出Recommendation信息。谢谢。
S*I
9 楼
你得去问语言学校；CPT的政策学校有很大自主性
【在 z***h 的大作中提到】
: 我有个比较棘手的问题，想请问各位大牛。
: 我去年毕业了，OPT一年，今年夏天OPT结束后在一个语言学校挂了F1身份，最近找到工
: 作了，目前谈的明年一月份报道上班，但是听说今年H1名额已经没了，我OPT也用完了
: ，我在语言学校可以CPT么？
: 或者谁知道什么语言学校可以挂F1，不去上课，能CPT的？
: 哪位高人帮帮我，私信也可以！
【在 z***h 的大作中提到】
: 我有个比较棘手的问题，想请问各位大牛。
: 我去年毕业了，OPT一年，今年夏天OPT结束后在一个语言学校挂了F1身份，最近找到工
: 作了，目前谈的明年一月份报道上班，但是听说今年H1名额已经没了，我OPT也用完了
: ，我在语言学校可以CPT么？
: 或者谁知道什么语言学校可以挂F1，不去上课，能CPT的？
: 哪位高人帮帮我，私信也可以！
c*e
10 楼
跟你受中间有多少剥削有关,我手下的contractor受两次剥削.
2倍很难,当然你要是能力超强也可能,我这里基本是剥削以后
跟full time差不多.
【在 t*****e 的大作中提到】
: 光算Base的话，Contractor Position 是Permannent Position的多少才值得考虑？
: 2倍，3倍，4倍？
2倍很难,当然你要是能力超强也可能,我这里基本是剥削以后
跟full time差不多.
【在 t*****e 的大作中提到】
: 光算Base的话，Contractor Position 是Permannent Position的多少才值得考虑？
: 2倍，3倍，4倍？
E*n
11 楼
德味浓啊，太毒了
s*y
12 楼
stacking gel 一般不应该超过1厘米。什么因素决定我不知道
除了量大，样品里的盐分过多或者含有一些改变水结构的有机溶剂（比方说DMSO,
guanadine) 也会让样品带涣散，和上样过多的结果类似
【在 p**i 的大作中提到】
: 1. stacking gel 应该多长，由那些因素决定?
: 2. 除了蛋白的量过大外，有什么其他因素会导致类似于overload的现象?
: 谢谢
除了量大，样品里的盐分过多或者含有一些改变水结构的有机溶剂（比方说DMSO,
guanadine) 也会让样品带涣散，和上样过多的结果类似
【在 p**i 的大作中提到】
: 1. stacking gel 应该多长，由那些因素决定?
: 2. 除了蛋白的量过大外，有什么其他因素会导致类似于overload的现象?
: 谢谢
z*h
13 楼
谢谢楼上的 我了解的几家语言学校都不行，我原来都听说过有的可以，但是都是很远
的听说，有没有哪位知道哪家学校可以的？！！
的听说，有没有哪位知道哪家学校可以的？！！
g*s
14 楼
中介公司占去不少
a*l
15 楼
网上说velvia50太浓太偏色，拍人皮肤会很发红，更适合拍风景，100更适合拍人。
p*i
16 楼
谢谢，stacking gel 过长有什么不良后果?
【在 s******y 的大作中提到】
: stacking gel 一般不应该超过1厘米。什么因素决定我不知道
: 除了量大，样品里的盐分过多或者含有一些改变水结构的有机溶剂（比方说DMSO,
: guanadine) 也会让样品带涣散，和上样过多的结果类似
【在 s******y 的大作中提到】
: stacking gel 一般不应该超过1厘米。什么因素决定我不知道
: 除了量大，样品里的盐分过多或者含有一些改变水结构的有机溶剂（比方说DMSO,
: guanadine) 也会让样品带涣散，和上样过多的结果类似
f*g
17 楼
请问楼主怎么找的语言学校?在哪?
本人也急需挂F1
本人也急需挂F1
M*l
18 楼
1.25-2之间，具体多少取决于个人能力高低和市场供需关系。
低于1.25基本上就是被剥削的厉害了。2以上比较难，除非是牛人。
【在 t*****e 的大作中提到】
: 光算Base的话，Contractor Position 是Permannent Position的多少才值得考虑？
: 2倍，3倍，4倍？
低于1.25基本上就是被剥削的厉害了。2以上比较难，除非是牛人。
【在 t*****e 的大作中提到】
: 光算Base的话，Contractor Position 是Permannent Position的多少才值得考虑？
: 2倍，3倍，4倍？
i*f
19 楼
where is人像啊
【在 s******g 的大作中提到】
: 阴天conservatory里面拍的，Velvia 50在低色温条件下的表达还是挺有意思的。
: 120MP这个头还是挺不错的，除了不是真微距。拍了拍人（老婆），觉得做人像头也很
: 好，比较灵活的一个头。
【在 s******g 的大作中提到】
: 阴天conservatory里面拍的，Velvia 50在低色温条件下的表达还是挺有意思的。
: 120MP这个头还是挺不错的，除了不是真微距。拍了拍人（老婆），觉得做人像头也很
: 好，比较灵活的一个头。
s*y
20 楼
好像没有什么特别大的后果，除了会占据本来应该属于seperation gel的空间。
【在 p**i 的大作中提到】
: 谢谢，stacking gel 过长有什么不良后果?
【在 p**i 的大作中提到】
: 谢谢，stacking gel 过长有什么不良后果?
u*g
21 楼
请问楼主可否把你挂的语言学校名字PM给我？包子奉上。
s*g
22 楼
欠奉呗
【在 i***f 的大作中提到】
: where is人像啊
【在 i***f 的大作中提到】
: where is人像啊
p*i
23 楼
哦，明白了。那我就搞得长一点。
上次跑样到stacking gel and seperating gel 边界线时有两个Well的样品还没出Well
，歪歪扭扭的, 结果gel的分辨率特低。这种情况Stacking gel 应该长点吧?
【在 s******y 的大作中提到】
: 好像没有什么特别大的后果，除了会占据本来应该属于seperation gel的空间。
上次跑样到stacking gel and seperating gel 边界线时有两个Well的样品还没出Well
，歪歪扭扭的, 结果gel的分辨率特低。这种情况Stacking gel 应该长点吧?
【在 s******y 的大作中提到】
: 好像没有什么特别大的后果，除了会占据本来应该属于seperation gel的空间。
N*Y
24 楼
蔡斯是艳妇，徕卡是贵妇
T*t
25 楼
stacking gel 1厘米就够了，再短的话，浓缩效果不好，再长的话，给分离胶留的空间
太少。你那两个well的样品没跑出well，很有可能是你的stacking gel浓度还是太高了
吧，或者那两个样品的盐浓度或者pH不对。
Well
【在 p**i 的大作中提到】
: 哦，明白了。那我就搞得长一点。
: 上次跑样到stacking gel and seperating gel 边界线时有两个Well的样品还没出Well
: ，歪歪扭扭的, 结果gel的分辨率特低。这种情况Stacking gel 应该长点吧?
太少。你那两个well的样品没跑出well，很有可能是你的stacking gel浓度还是太高了
吧，或者那两个样品的盐浓度或者pH不对。
Well
【在 p**i 的大作中提到】
: 哦，明白了。那我就搞得长一点。
: 上次跑样到stacking gel and seperating gel 边界线时有两个Well的样品还没出Well
: ，歪歪扭扭的, 结果gel的分辨率特低。这种情况Stacking gel 应该长点吧?
s*g
26 楼
有荡妇么
【在 N**Y 的大作中提到】
: 蔡斯是艳妇，徕卡是贵妇
【在 N**Y 的大作中提到】
: 蔡斯是艳妇，徕卡是贵妇
s*y
27 楼
对。估计是楼主的样品里的盐浓度不对。
ｐＨ也可能不对，但是这个应该比较容易看出来，因为如果样品太酸的话上样液的色素
就会变绿色甚至黄色，很容易就注意到了。
【在 T**********t 的大作中提到】
: stacking gel 1厘米就够了，再短的话，浓缩效果不好，再长的话，给分离胶留的空间
: 太少。你那两个well的样品没跑出well，很有可能是你的stacking gel浓度还是太高了
: 吧，或者那两个样品的盐浓度或者pH不对。
:
: Well
ｐＨ也可能不对，但是这个应该比较容易看出来，因为如果样品太酸的话上样液的色素
就会变绿色甚至黄色，很容易就注意到了。
【在 T**********t 的大作中提到】
: stacking gel 1厘米就够了，再短的话，浓缩效果不好，再长的话，给分离胶留的空间
: 太少。你那两个well的样品没跑出well，很有可能是你的stacking gel浓度还是太高了
: 吧，或者那两个样品的盐浓度或者pH不对。
:
: Well
c*d
28 楼
蔡司都是偏冷色么。
朋友有个50mm的也是这种感觉
朋友有个50mm的也是这种感觉
p*i
29 楼
谢谢T兄，stacking gel浓度还是只有4%。那可能是样品的问题，protein standard 就
跑得挺快的。
那应该咋样调样品的pH和盐浓度呢? 总共就那么一点小体积
【在 T**********t 的大作中提到】
: stacking gel 1厘米就够了，再短的话，浓缩效果不好，再长的话，给分离胶留的空间
: 太少。你那两个well的样品没跑出well，很有可能是你的stacking gel浓度还是太高了
: 吧，或者那两个样品的盐浓度或者pH不对。
:
: Well
跑得挺快的。
那应该咋样调样品的pH和盐浓度呢? 总共就那么一点小体积
【在 T**********t 的大作中提到】
: stacking gel 1厘米就够了，再短的话，浓缩效果不好，再长的话，给分离胶留的空间
: 太少。你那两个well的样品没跑出well，很有可能是你的stacking gel浓度还是太高了
: 吧，或者那两个样品的盐浓度或者pH不对。
:
: Well
i*f
30 楼
宾德
【在 s******g 的大作中提到】
: 有荡妇么
【在 s******g 的大作中提到】
: 有荡妇么
p*i
31 楼
好象颜色是有点类似绿黄色，那这种情况你是如何调的呢?
【在 s******y 的大作中提到】
: 对。估计是楼主的样品里的盐浓度不对。
: ｐＨ也可能不对，但是这个应该比较容易看出来，因为如果样品太酸的话上样液的色素
: 就会变绿色甚至黄色，很容易就注意到了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 对。估计是楼主的样品里的盐浓度不对。
: ｐＨ也可能不对，但是这个应该比较容易看出来，因为如果样品太酸的话上样液的色素
: 就会变绿色甚至黄色，很容易就注意到了。
s*g
32 楼
我一直以为宾得都是小家碧玉。。。
【在 i***f 的大作中提到】
: 宾德
【在 i***f 的大作中提到】
: 宾德
O*e
33 楼
stacking gel太短了，蛋白凑不到一块；太长了，你separation gel就短了。
【在 s******y 的大作中提到】
: stacking gel 一般不应该超过1厘米。什么因素决定我不知道
: 除了量大，样品里的盐分过多或者含有一些改变水结构的有机溶剂（比方说DMSO,
: guanadine) 也会让样品带涣散，和上样过多的结果类似
【在 s******y 的大作中提到】
: stacking gel 一般不应该超过1厘米。什么因素决定我不知道
: 除了量大，样品里的盐分过多或者含有一些改变水结构的有机溶剂（比方说DMSO,
: guanadine) 也会让样品带涣散，和上样过多的结果类似
s*y
34 楼
加点1M tris pH 8.8 buffer, 或者直接加一点稀NaOH
直到颜色变成蓝色
【在 p**i 的大作中提到】
: 好象颜色是有点类似绿黄色，那这种情况你是如何调的呢?
直到颜色变成蓝色
【在 p**i 的大作中提到】
: 好象颜色是有点类似绿黄色，那这种情况你是如何调的呢?
s*y
35 楼
加点1M tris pH 8.8 buffer, 或者直接加一点稀NaOH
直到颜色变成蓝色
【在 p**i 的大作中提到】
: 好象颜色是有点类似绿黄色，那这种情况你是如何调的呢?
直到颜色变成蓝色
【在 p**i 的大作中提到】
: 好象颜色是有点类似绿黄色，那这种情况你是如何调的呢?
p*i
36 楼
太感谢了! 从没注意到这现象，枉我做了这么多年蛋白实验。以前Bacteria蛋白表达，
提纯，结晶都没有这些问题。现在是用SDS Sample Buffer 洗Biotin Beads并浓缩后有
的这问题。
此外什么样的蛋白样品容易有pH的问题?
【在 s******y 的大作中提到】
: 加点1M tris pH 8.8 buffer, 或者直接加一点稀NaOH
: 直到颜色变成蓝色
提纯，结晶都没有这些问题。现在是用SDS Sample Buffer 洗Biotin Beads并浓缩后有
的这问题。
此外什么样的蛋白样品容易有pH的问题?
【在 s******y 的大作中提到】
: 加点1M tris pH 8.8 buffer, 或者直接加一点稀NaOH
: 直到颜色变成蓝色
p*i
37 楼
是的，不过这回跑的大胶，这方面的考虑可以松一点
【在 O******e 的大作中提到】
: stacking gel太短了，蛋白凑不到一块；太长了，你separation gel就短了。
【在 O******e 的大作中提到】
: stacking gel太短了，蛋白凑不到一块；太长了，你separation gel就短了。
s*y
38 楼
当然是酸性的蛋白容易有pH 问题啦。哈哈。
另外，你的biotin bead 里的残留液如果很酸的话也会带来问题。
又另外，你的biotin bead 里有没有类似guanadine or DMSO 这种东西？你是用什么东
西来
洗脱biotin的？ 因为在我的印象中，单纯的SDS-buffer 是不能充分打开biotin-
stravadin
的结合的。
【在 p**i 的大作中提到】
: 太感谢了! 从没注意到这现象，枉我做了这么多年蛋白实验。以前Bacteria蛋白表达，
: 提纯，结晶都没有这些问题。现在是用SDS Sample Buffer 洗Biotin Beads并浓缩后有
: 的这问题。
: 此外什么样的蛋白样品容易有pH的问题?
另外，你的biotin bead 里的残留液如果很酸的话也会带来问题。
又另外，你的biotin bead 里有没有类似guanadine or DMSO 这种东西？你是用什么东
西来
洗脱biotin的？ 因为在我的印象中，单纯的SDS-buffer 是不能充分打开biotin-
stravadin
的结合的。
【在 p**i 的大作中提到】
: 太感谢了! 从没注意到这现象，枉我做了这么多年蛋白实验。以前Bacteria蛋白表达，
: 提纯，结晶都没有这些问题。现在是用SDS Sample Buffer 洗Biotin Beads并浓缩后有
: 的这问题。
: 此外什么样的蛋白样品容易有pH的问题?
T*t
39 楼
SDS buffer加上煮沸应该是可以打开biotin-streptavidin的结合的。invitrogen的
dyna beads的说明书里我记得说过。
【在 s******y 的大作中提到】
: 当然是酸性的蛋白容易有pH 问题啦。哈哈。
: 另外，你的biotin bead 里的残留液如果很酸的话也会带来问题。
: 又另外，你的biotin bead 里有没有类似guanadine or DMSO 这种东西？你是用什么东
: 西来
: 洗脱biotin的？ 因为在我的印象中，单纯的SDS-buffer 是不能充分打开biotin-
: stravadin
: 的结合的。
dyna beads的说明书里我记得说过。
【在 s******y 的大作中提到】
: 当然是酸性的蛋白容易有pH 问题啦。哈哈。
: 另外，你的biotin bead 里的残留液如果很酸的话也会带来问题。
: 又另外，你的biotin bead 里有没有类似guanadine or DMSO 这种东西？你是用什么东
: 西来
: 洗脱biotin的？ 因为在我的印象中，单纯的SDS-buffer 是不能充分打开biotin-
: stravadin
: 的结合的。
T*t
40 楼
你的loading buffer是有pH缓冲能力的，如果你的样品最终pH不对，说明buffer缓冲能
力不够。一般SDS胶的loading buffer是用的cathode buffer的1/4浓度，你把它提高到
1/2或者更高好了。或者像sunnyday同学说的那样，直接加NaOH调上去。
【在 p**i 的大作中提到】
: 谢谢T兄，stacking gel浓度还是只有4%。那可能是样品的问题，protein standard 就
: 跑得挺快的。
: 那应该咋样调样品的pH和盐浓度呢? 总共就那么一点小体积
力不够。一般SDS胶的loading buffer是用的cathode buffer的1/4浓度，你把它提高到
1/2或者更高好了。或者像sunnyday同学说的那样，直接加NaOH调上去。
【在 p**i 的大作中提到】
: 谢谢T兄，stacking gel浓度还是只有4%。那可能是样品的问题，protein standard 就
: 跑得挺快的。
: 那应该咋样调样品的pH和盐浓度呢? 总共就那么一点小体积
p*i
41 楼
我也不知道这Beads是不是有带酸性的东西，一会查查instruction。我的目的不是洗脱
Targeting protein，而是和Targeting protein interact的proteins，所以SDS
Sample Buffer 应该可以了。
对了，你用过spin-X UF concentrator 吧。有的时候蛋白浓度很低却浓缩的很慢，是
不是也有pH的因素?
【在 s******y 的大作中提到】
: 当然是酸性的蛋白容易有pH 问题啦。哈哈。
: 另外，你的biotin bead 里的残留液如果很酸的话也会带来问题。
: 又另外，你的biotin bead 里有没有类似guanadine or DMSO 这种东西？你是用什么东
: 西来
: 洗脱biotin的？ 因为在我的印象中，单纯的SDS-buffer 是不能充分打开biotin-
: stravadin
: 的结合的。
Targeting protein，而是和Targeting protein interact的proteins，所以SDS
Sample Buffer 应该可以了。
对了，你用过spin-X UF concentrator 吧。有的时候蛋白浓度很低却浓缩的很慢，是
不是也有pH的因素?
【在 s******y 的大作中提到】
: 当然是酸性的蛋白容易有pH 问题啦。哈哈。
: 另外，你的biotin bead 里的残留液如果很酸的话也会带来问题。
: 又另外，你的biotin bead 里有没有类似guanadine or DMSO 这种东西？你是用什么东
: 西来
: 洗脱biotin的？ 因为在我的印象中，单纯的SDS-buffer 是不能充分打开biotin-
: stravadin
: 的结合的。
s*y
42 楼
我用过很多不同公司来源的concentrator,
浓缩慢的原因一般是：
１。膜的孔太小
２。蛋白带有糖基，太粘，把膜的孔堵住了
【在 p**i 的大作中提到】
: 我也不知道这Beads是不是有带酸性的东西，一会查查instruction。我的目的不是洗脱
: Targeting protein，而是和Targeting protein interact的proteins，所以SDS
: Sample Buffer 应该可以了。
: 对了，你用过spin-X UF concentrator 吧。有的时候蛋白浓度很低却浓缩的很慢，是
: 不是也有pH的因素?
浓缩慢的原因一般是：
１。膜的孔太小
２。蛋白带有糖基，太粘，把膜的孔堵住了
【在 p**i 的大作中提到】
: 我也不知道这Beads是不是有带酸性的东西，一会查查instruction。我的目的不是洗脱
: Targeting protein，而是和Targeting protein interact的proteins，所以SDS
: Sample Buffer 应该可以了。
: 对了，你用过spin-X UF concentrator 吧。有的时候蛋白浓度很低却浓缩的很慢，是
: 不是也有pH的因素?
T*t
43 楼
这种concentrator是靠离心力和滤膜来浓缩的，跟pH没什么关系吧。很慢是多慢？如果
浓缩得比正常的慢，可能是滤膜上的孔被堵上了。你的蛋白大么? 用的concentrator的
mwco是多高啊？
【在 p**i 的大作中提到】
: 我也不知道这Beads是不是有带酸性的东西，一会查查instruction。我的目的不是洗脱
: Targeting protein，而是和Targeting protein interact的proteins，所以SDS
: Sample Buffer 应该可以了。
: 对了，你用过spin-X UF concentrator 吧。有的时候蛋白浓度很低却浓缩的很慢，是
: 不是也有pH的因素?
浓缩得比正常的慢，可能是滤膜上的孔被堵上了。你的蛋白大么? 用的concentrator的
mwco是多高啊？
【在 p**i 的大作中提到】
: 我也不知道这Beads是不是有带酸性的东西，一会查查instruction。我的目的不是洗脱
: Targeting protein，而是和Targeting protein interact的proteins，所以SDS
: Sample Buffer 应该可以了。
: 对了，你用过spin-X UF concentrator 吧。有的时候蛋白浓度很低却浓缩的很慢，是
: 不是也有pH的因素?
p*i
44 楼
是指提高Tris-Cl的浓度吗?
【在 T**********t 的大作中提到】
: 你的loading buffer是有pH缓冲能力的，如果你的样品最终pH不对，说明buffer缓冲能
: 力不够。一般SDS胶的loading buffer是用的cathode buffer的1/4浓度，你把它提高到
: 1/2或者更高好了。或者像sunnyday同学说的那样，直接加NaOH调上去。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 你的loading buffer是有pH缓冲能力的，如果你的样品最终pH不对，说明buffer缓冲能
: 力不够。一般SDS胶的loading buffer是用的cathode buffer的1/4浓度，你把它提高到
: 1/2或者更高好了。或者像sunnyday同学说的那样，直接加NaOH调上去。
s*y
45 楼
除非是那个人工作的biotin analog,
天然的biotin 需要用6M urea + 2M thiolurea 来洗脱。
光用SDS-buffer 效果很差的。
【在 T**********t 的大作中提到】
: SDS buffer加上煮沸应该是可以打开biotin-streptavidin的结合的。invitrogen的
: dyna beads的说明书里我记得说过。
天然的biotin 需要用6M urea + 2M thiolurea 来洗脱。
光用SDS-buffer 效果很差的。
【在 T**********t 的大作中提到】
: SDS buffer加上煮沸应该是可以打开biotin-streptavidin的结合的。invitrogen的
: dyna beads的说明书里我记得说过。
p*i
46 楼
10 K 的孔，不能再小了。糖基有这么大的影响啊?
【在 s******y 的大作中提到】
: 我用过很多不同公司来源的concentrator,
: 浓缩慢的原因一般是：
: １。膜的孔太小
: ２。蛋白带有糖基，太粘，把膜的孔堵住了
【在 s******y 的大作中提到】
: 我用过很多不同公司来源的concentrator,
: 浓缩慢的原因一般是：
: １。膜的孔太小
: ２。蛋白带有糖基，太粘，把膜的孔堵住了
s*y
47 楼
不是，他是让你把４ｘbuffer 多加一点。
比方说１：２
【在 p**i 的大作中提到】
: 是指提高Tris-Cl的浓度吗?
比方说１：２
【在 p**i 的大作中提到】
: 是指提高Tris-Cl的浓度吗?
s*y
48 楼
１０Ｋ的膜过滤起来是比较慢。耐心点好了
【在 p**i 的大作中提到】
: 10 K 的孔，不能再小了。糖基有这么大的影响啊?
【在 p**i 的大作中提到】
: 10 K 的孔，不能再小了。糖基有这么大的影响啊?
p*i
49 楼
明明跑胶只能看见几个弱的条带，经常需要浓缩一天才能从2 ml到100 ul. 10 KDa
mwco.
【在 T**********t 的大作中提到】
: 这种concentrator是靠离心力和滤膜来浓缩的，跟pH没什么关系吧。很慢是多慢？如果
: 浓缩得比正常的慢，可能是滤膜上的孔被堵上了。你的蛋白大么? 用的concentrator的
: mwco是多高啊？
mwco.
【在 T**********t 的大作中提到】
: 这种concentrator是靠离心力和滤膜来浓缩的，跟pH没什么关系吧。很慢是多慢？如果
: 浓缩得比正常的慢，可能是滤膜上的孔被堵上了。你的蛋白大么? 用的concentrator的
: mwco是多高啊？
T*t
50 楼
是。就是让loading buffer的缓冲能力高一点。
【在 p**i 的大作中提到】
: 是指提高Tris-Cl的浓度吗?
【在 p**i 的大作中提到】
: 是指提高Tris-Cl的浓度吗?
p*i
51 楼
明白了，例如把4X当2X用?
【在 s******y 的大作中提到】
: 不是，他是让你把４ｘbuffer 多加一点。
: 比方说１：２
【在 s******y 的大作中提到】
: 不是，他是让你把４ｘbuffer 多加一点。
: 比方说１：２
s*y
52 楼
你的蛋白多大？
【在 p**i 的大作中提到】
: 明明跑胶只能看见几个弱的条带，经常需要浓缩一天才能从2 ml到100 ul. 10 KDa
: mwco.
【在 p**i 的大作中提到】
: 明明跑胶只能看见几个弱的条带，经常需要浓缩一天才能从2 ml到100 ul. 10 KDa
: mwco.
T*t
53 楼
效果也等同于把Tris的浓度提高了嘛，一样的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 不是，他是让你把４ｘbuffer 多加一点。
: 比方说１：２
【在 s******y 的大作中提到】
: 不是，他是让你把４ｘbuffer 多加一点。
: 比方说１：２
p*i
54 楼
不知道，是未知的
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的蛋白多大？
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的蛋白多大？
s*y
55 楼
对
【在 p**i 的大作中提到】
: 明白了，例如把4X当2X用?
【在 p**i 的大作中提到】
: 明白了，例如把4X当2X用?
s*y
56 楼
在胶上和标准比较一下大概有多大？
【在 p**i 的大作中提到】
: 不知道，是未知的
【在 p**i 的大作中提到】
: 不知道，是未知的
s*y
57 楼
在胶上和标准比较一下大概有多大？
【在 p**i 的大作中提到】
: 不知道，是未知的
【在 p**i 的大作中提到】
: 不知道，是未知的
T*t
58 楼
哦，我没比较过，因为我一般不需要把结合上去的蛋白再洗下来。
我就是看说明书上这么说的：
2.2 Release of Immobilized Biotinylated Molecules
The biotin-streptavidin bond is broken by harsh conditions. 5 mins
incubation at 65°C or 2 mins at 90°C in 10 mM EDTA pH 8.2 with 95%
formamide will typically dissociate >96% of immobilized biotinylated DNA.
Alternatively, boil the sample for 5 mins in 0.1% SDS for
protein dissociation.
Please note that proteins will be denatured by such treatment and Dynabeads
Streptavidin can not be re-used.
It has al
【在 s******y 的大作中提到】
: 除非是那个人工作的biotin analog,
: 天然的biotin 需要用6M urea + 2M thiolurea 来洗脱。
: 光用SDS-buffer 效果很差的。
我就是看说明书上这么说的：
2.2 Release of Immobilized Biotinylated Molecules
The biotin-streptavidin bond is broken by harsh conditions. 5 mins
incubation at 65°C or 2 mins at 90°C in 10 mM EDTA pH 8.2 with 95%
formamide will typically dissociate >96% of immobilized biotinylated DNA.
Alternatively, boil the sample for 5 mins in 0.1% SDS for
protein dissociation.
Please note that proteins will be denatured by such treatment and Dynabeads
Streptavidin can not be re-used.
It has al
【在 s******y 的大作中提到】
: 除非是那个人工作的biotin analog,
: 天然的biotin 需要用6M urea + 2M thiolurea 来洗脱。
: 光用SDS-buffer 效果很差的。
s*y
59 楼
在胶上和标准比较一下大概有多大？
【在 p**i 的大作中提到】
: 不知道，是未知的
【在 p**i 的大作中提到】
: 不知道，是未知的
T*t
60 楼
听起来是很慢。
我用GE的viva-spin，5K的mwco，从100多ml浓缩到1ml左右也就一天。会不会体积越小
越不好浓缩？我知道vivaspin的话，是有dead stop volume的，是为了防止样品浓缩干
，所以最下面没有滤膜，样品如果少的话，那么能利用的有效滤膜面积也就少了。
不过我从来没试过浓缩到100ul那么低，不知道是不是这样。
【在 p**i 的大作中提到】
: 明明跑胶只能看见几个弱的条带，经常需要浓缩一天才能从2 ml到100 ul. 10 KDa
: mwco.
我用GE的viva-spin，5K的mwco，从100多ml浓缩到1ml左右也就一天。会不会体积越小
越不好浓缩？我知道vivaspin的话，是有dead stop volume的，是为了防止样品浓缩干
，所以最下面没有滤膜，样品如果少的话，那么能利用的有效滤膜面积也就少了。
不过我从来没试过浓缩到100ul那么低，不知道是不是这样。
【在 p**i 的大作中提到】
: 明明跑胶只能看见几个弱的条带，经常需要浓缩一天才能从2 ml到100 ul. 10 KDa
: mwco.
p*i
61 楼
有几条带，不知道那个是
【在 s******y 的大作中提到】
: 在胶上和标准比较一下大概有多大？
【在 s******y 的大作中提到】
: 在胶上和标准比较一下大概有多大？
p*i
62 楼
非常可能如你所说，并非样品本身的原因，而是体积太小。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 听起来是很慢。
: 我用GE的viva-spin，5K的mwco，从100多ml浓缩到1ml左右也就一天。会不会体积越小
: 越不好浓缩？我知道vivaspin的话，是有dead stop volume的，是为了防止样品浓缩干
: ，所以最下面没有滤膜，样品如果少的话，那么能利用的有效滤膜面积也就少了。
: 不过我从来没试过浓缩到100ul那么低，不知道是不是这样。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 听起来是很慢。
: 我用GE的viva-spin，5K的mwco，从100多ml浓缩到1ml左右也就一天。会不会体积越小
: 越不好浓缩？我知道vivaspin的话，是有dead stop volume的，是为了防止样品浓缩干
: ，所以最下面没有滤膜，样品如果少的话，那么能利用的有效滤膜面积也就少了。
: 不过我从来没试过浓缩到100ul那么低，不知道是不是这样。
s*y
63 楼
这个也有可能是因为你的蛋白把膜上的孔堵住了。特别是如果你需要
浓缩很多倍的话。
我们以前如果需要浓缩10倍以上的话，会使用那种倒置式的concentrator,
就是膜在溶液上方的那种，忘记是哪里买的了，好像是在fisher。
【在 p**i 的大作中提到】
: 明明跑胶只能看见几个弱的条带，经常需要浓缩一天才能从2 ml到100 ul. 10 KDa
: mwco.
浓缩很多倍的话。
我们以前如果需要浓缩10倍以上的话，会使用那种倒置式的concentrator,
就是膜在溶液上方的那种，忘记是哪里买的了，好像是在fisher。
【在 p**i 的大作中提到】
: 明明跑胶只能看见几个弱的条带，经常需要浓缩一天才能从2 ml到100 ul. 10 KDa
: mwco.
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