用qPCR检测mRNA，高1000倍，却看不到蛋白# Biology - 生物学
r*g
1 楼
《湄公河行动》就不能像《黑鹰坠落（Black Hawk Down）》一样拍的稍微真实一点吗？
好好的一个现实题材非要拍成超人世界大战吗？
不懂为什么这么多人追捧。炒作？YY？
好好的一个现实题材非要拍成超人世界大战吗？
不懂为什么这么多人追捧。炒作？YY？
v*a
2 楼
做的是蛋白的overexpression，用抗体都看不到overexpression后蛋白level有变化，
但用普通的PCR和real-time PCR检测，却都有非常高的mRNA增量。特别是real-time
PCR，分析后竟然mRNA level在overexpression后增加了快1000倍。有这个可能吗？
但用普通的PCR和real-time PCR检测，却都有非常高的mRNA增量。特别是real-time
PCR，分析后竟然mRNA level在overexpression后增加了快1000倍。有这个可能吗？
r*e
3 楼
当然可能，极端的例子，载体的cDNA突变了没表达，但mRNA还在啊。
【在 v***a 的大作中提到】
: 做的是蛋白的overexpression，用抗体都看不到overexpression后蛋白level有变化，
: 但用普通的PCR和real-time PCR检测，却都有非常高的mRNA增量。特别是real-time
: PCR，分析后竟然mRNA level在overexpression后增加了快1000倍。有这个可能吗？
【在 v***a 的大作中提到】
: 做的是蛋白的overexpression，用抗体都看不到overexpression后蛋白level有变化，
: 但用普通的PCR和real-time PCR检测，却都有非常高的mRNA增量。特别是real-time
: PCR，分析后竟然mRNA level在overexpression后增加了快1000倍。有这个可能吗？
k*o
4 楼
测个序会比较清楚。
h*r
5 楼
把载体测个序检查阅读框是不是对的，有没有缺失或插入。
如果没问题，你就发了。发现一个非常不稳定的蛋白。拿MG132处理下，看看蛋白是不
是稳定那
如果没问题，你就发了。发现一个非常不稳定的蛋白。拿MG132处理下，看看蛋白是不
是稳定那
v*a
6 楼
天……我overexpress的是一个extensively studied的蛋白。。。没有文献报导过它不
稳定。那是阅读框错了？但是overexpress后，细胞的一些signaling pathway确实跟预
测的一样有相应的变化
【在 h****r 的大作中提到】
: 把载体测个序检查阅读框是不是对的，有没有缺失或插入。
: 如果没问题，你就发了。发现一个非常不稳定的蛋白。拿MG132处理下，看看蛋白是不
: 是稳定那
稳定。那是阅读框错了？但是overexpress后，细胞的一些signaling pathway确实跟预
测的一样有相应的变化
【在 h****r 的大作中提到】
: 把载体测个序检查阅读框是不是对的，有没有缺失或插入。
: 如果没问题，你就发了。发现一个非常不稳定的蛋白。拿MG132处理下，看看蛋白是不
: 是稳定那
B*o
7 楼
你的抗体确定能识别那个蛋白么？还是在size差不多的地方识别的一个杂带啊？
【在 v***a 的大作中提到】
: 天……我overexpress的是一个extensively studied的蛋白。。。没有文献报导过它不
: 稳定。那是阅读框错了？但是overexpress后，细胞的一些signaling pathway确实跟预
: 测的一样有相应的变化
【在 v***a 的大作中提到】
: 天……我overexpress的是一个extensively studied的蛋白。。。没有文献报导过它不
: 稳定。那是阅读框错了？但是overexpress后，细胞的一些signaling pathway确实跟预
: 测的一样有相应的变化
l*i
8 楼
加Kozak了么？
增加1000倍，可能只是本底很低，因为基因沉默的缘故，其实也可能低于正常水平。
【在 v***a 的大作中提到】
: 做的是蛋白的overexpression，用抗体都看不到overexpression后蛋白level有变化，
: 但用普通的PCR和real-time PCR检测，却都有非常高的mRNA增量。特别是real-time
: PCR，分析后竟然mRNA level在overexpression后增加了快1000倍。有这个可能吗？
增加1000倍，可能只是本底很低，因为基因沉默的缘故，其实也可能低于正常水平。
【在 v***a 的大作中提到】
: 做的是蛋白的overexpression，用抗体都看不到overexpression后蛋白level有变化，
: 但用普通的PCR和real-time PCR检测，却都有非常高的mRNA增量。特别是real-time
: PCR，分析后竟然mRNA level在overexpression后增加了快1000倍。有这个可能吗？
v*a
9 楼
没有。弱弱地问，kozak是啥？
是的，我的对照mRNA level看起来不高。
【在 l*****i 的大作中提到】
: 加Kozak了么？
: 增加1000倍，可能只是本底很低，因为基因沉默的缘故，其实也可能低于正常水平。
是的，我的对照mRNA level看起来不高。
【在 l*****i 的大作中提到】
: 加Kozak了么？
: 增加1000倍，可能只是本底很低，因为基因沉默的缘故，其实也可能低于正常水平。
m*p
10 楼
别像我，overexpress q-pcr 检测也高达2000， 最后发现抗体有问题。
m*m
11 楼
给cDNA加个tag吧，Flag什么的，用tag的抗体检测，
要是做IP之类的也容易得多。
要是做IP之类的也容易得多。
K*a
12 楼
有可能是cosuppression
h*9
13 楼
个人谨慎的猜测你PCR/real-time PCR检测的是质粒的gDNA=cDNA。一个有control没有,
差别上千倍不稀罕。建议测序质粒看看有无错误或者做一个non-RT control。
【在 v***a 的大作中提到】
: 做的是蛋白的overexpression，用抗体都看不到overexpression后蛋白level有变化，
: 但用普通的PCR和real-time PCR检测，却都有非常高的mRNA增量。特别是real-time
: PCR，分析后竟然mRNA level在overexpression后增加了快1000倍。有这个可能吗？
差别上千倍不稀罕。建议测序质粒看看有无错误或者做一个non-RT control。
【在 v***a 的大作中提到】
: 做的是蛋白的overexpression，用抗体都看不到overexpression后蛋白level有变化，
: 但用普通的PCR和real-time PCR检测，却都有非常高的mRNA增量。特别是real-time
: PCR，分析后竟然mRNA level在overexpression后增加了快1000倍。有这个可能吗？
s*u
14 楼
support
有,
【在 h*****9 的大作中提到】
: 个人谨慎的猜测你PCR/real-time PCR检测的是质粒的gDNA=cDNA。一个有control没有,
: 差别上千倍不稀罕。建议测序质粒看看有无错误或者做一个non-RT control。
有,
【在 h*****9 的大作中提到】
: 个人谨慎的猜测你PCR/real-time PCR检测的是质粒的gDNA=cDNA。一个有control没有,
: 差别上千倍不稀罕。建议测序质粒看看有无错误或者做一个non-RT control。
L*S
15 楼
hand
有,
【在 h*****9 的大作中提到】
: 个人谨慎的猜测你PCR/real-time PCR检测的是质粒的gDNA=cDNA。一个有control没有,
: 差别上千倍不稀罕。建议测序质粒看看有无错误或者做一个non-RT control。
有,
【在 h*****9 的大作中提到】
: 个人谨慎的猜测你PCR/real-time PCR检测的是质粒的gDNA=cDNA。一个有control没有,
: 差别上千倍不稀罕。建议测序质粒看看有无错误或者做一个non-RT control。
l*1
16 楼
LZ为了过份表达 选的promoter inserted xxxxx bases upstream of the Start codon may affect the Kozak
sequence or rbs.
then a nonsense mutation is a mutation that causes a premature stop,
resulting in a truncated or nonfunctional protein
NB: if it is my misunderstood please let me know it.
回复]
>发信人: vonda (Vonda), 信区: Biology
标 题: Re: 用qPCR检测mRNA，高1000倍，却看不到蛋白
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jan 31 19:01:56 2012, 美东)
天……我overexpress的是一个extensively studied的蛋白。。。没有文献报导过它不
稳定。那是阅读框错了？但是overexpress后，细胞的一些signaling pathway确实跟预
测的一样有相应的变化
----
for KOZAK it is family name of one researcher:
his 1989 paper:
M. Kozak, J. Cell Biol. 108, 229-
full text pdf file you can get from link:
//jcb.rupress.org/content/108/2/229.abstract
more try go to
//molecularbiology.forums.biotechniques.com/viewtopic.php?p=70258
In eukaryotes the functional ATG must contain a Kozak sequence. This
requires a purine (A or G) at -3, and preferably a G at +1: AccATGG. The
ideal consensus sequence is (A/G)cc(A/G)ccATGG... (It can work sometimes
without the -3 A, but you might as well make sure its there).
(FYI, a nonsense mutation is a mutation that causes a premature stop,
resulting in a truncated or nonfunctional protein.)
by relaxin » Sep 19 2008
What kind of expression vector are you using, prokaryotic or mammalian? Your
inserted six bases upstream of the Start codon may affect the Kozak
sequence or rbs.
and
f-t-p://195.214.211.1/books/DVD-029/Doolittle_R.,_Abelson_J.,_Simon_M._
Computer_Methods_for_Macromolecular_Sequence_Analysis_(1996)(en)(711s).pdf
【在 h****r 的大作中提到】
: 把载体测个序检查阅读框是不是对的，有没有缺失或插入。
: 如果没问题，你就发了。发现一个非常不稳定的蛋白。拿MG132处理下，看看蛋白是不
: 是稳定那
sequence or rbs.
then a nonsense mutation is a mutation that causes a premature stop,
resulting in a truncated or nonfunctional protein
NB: if it is my misunderstood please let me know it.
回复]
>发信人: vonda (Vonda), 信区: Biology
标 题: Re: 用qPCR检测mRNA，高1000倍，却看不到蛋白
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jan 31 19:01:56 2012, 美东)
天……我overexpress的是一个extensively studied的蛋白。。。没有文献报导过它不
稳定。那是阅读框错了？但是overexpress后，细胞的一些signaling pathway确实跟预
测的一样有相应的变化
----
for KOZAK it is family name of one researcher:
his 1989 paper:
M. Kozak, J. Cell Biol. 108, 229-
full text pdf file you can get from link:
//jcb.rupress.org/content/108/2/229.abstract
more try go to
//molecularbiology.forums.biotechniques.com/viewtopic.php?p=70258
In eukaryotes the functional ATG must contain a Kozak sequence. This
requires a purine (A or G) at -3, and preferably a G at +1: AccATGG. The
ideal consensus sequence is (A/G)cc(A/G)ccATGG... (It can work sometimes
without the -3 A, but you might as well make sure its there).
(FYI, a nonsense mutation is a mutation that causes a premature stop,
resulting in a truncated or nonfunctional protein.)
by relaxin » Sep 19 2008
What kind of expression vector are you using, prokaryotic or mammalian? Your
inserted six bases upstream of the Start codon may affect the Kozak
sequence or rbs.
and
f-t-p://195.214.211.1/books/DVD-029/Doolittle_R.,_Abelson_J.,_Simon_M._
Computer_Methods_for_Macromolecular_Sequence_Analysis_(1996)(en)(711s).pdf
【在 h****r 的大作中提到】
: 把载体测个序检查阅读框是不是对的，有没有缺失或插入。
: 如果没问题，你就发了。发现一个非常不稳定的蛋白。拿MG132处理下，看看蛋白是不
: 是稳定那
s*y
17 楼
对。
在细胞被转染的情况下，必须用DNase 反复处理提出来的RNA 然后才能做
RT-PCR and q-PCR
直接做的话肯定会得出这个高1000倍的结论
有,
【在 h*****9 的大作中提到】
: 个人谨慎的猜测你PCR/real-time PCR检测的是质粒的gDNA=cDNA。一个有control没有,
: 差别上千倍不稀罕。建议测序质粒看看有无错误或者做一个non-RT control。
在细胞被转染的情况下，必须用DNase 反复处理提出来的RNA 然后才能做
RT-PCR and q-PCR
直接做的话肯定会得出这个高1000倍的结论
有,
【在 h*****9 的大作中提到】
: 个人谨慎的猜测你PCR/real-time PCR检测的是质粒的gDNA=cDNA。一个有control没有,
: 差别上千倍不稀罕。建议测序质粒看看有无错误或者做一个non-RT control。
Z*g
18 楼
多半是质粒DNA污染造成的.
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