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有人做过pAKT western blot的么?
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有人做过pAKT western blot的么?# Biology - 生物学
s*u
1
发信人: bulletin (bulletin), 信区: FDU
标 题: 复旦前经济学院院长走上信访道路
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jul 7 13:57:55 2012, 美东)
http://zx.china-b.com/fddx/zixun_13405.html
信访群体,好多人的印象是衣衫不整、满面沧桑的形象。然而,2005年秋以来,上海的
信访洪流中却多了张令人感慨万千的面孔。他,不到50岁,清瘦,戴副眼镜,一眼便知
是个学者。每个关心中国发展的人,立马就可认出他就是先被警方认定为“嫖娼”,接
着遭到校方“ 双开”,后又引起媒体炒作,现在声明狼籍,赋闲在家的中国著名经济
学家、复旦大学经济学院前院长陆德明。
如果说,由于种种原因被边缘化而不得不走上信访道路的人们是弱势群体的话,那
么这位学者则属于弱者中的弱者。平日,在一些党政机关的前后左右,总有信访者的身
影。甚至,好多人早已经做好了一旦警察来制止就甘愿被拘的准备。鉴此,有人说他们
不懂法,甚至称为刁民。但是,身为经济学家的陆德明,同时也懂得信访的规矩,表现
出的就是温顺和文明。不过,这一文明信访,可害苦了他,等来是冷水浇头。
“嫖娼教授”、“教授嫖娼”......成了舆论的热点词汇之际,陆德明选择的是把
自己关在家里。只要一出门,就会觉得有千千万万双毒辣的目光注释着他,并且很鄙夷
。这种不见阳光的日子,他称“死亡状态”。这期间,陆德明丧失了依法提起行政复议
和行政诉讼的机会。按理说,任何公民在受到行政处罚之后,行政复议和行政诉讼的期
限未过,都不应算作铁案,即最后结论。可恰恰就是,复旦依据公安机关尚且带着余热
的《行政处罚书》对陆德明作出了开除党籍、行政撤职和留校查看的处分,接着媒体又
一轰而上,轮番炒作。
丧失了行政复议和行政诉讼的机会,陆德明剩下的就只有信访了。而又之所以说他
的为己申冤是文明信访,还在于他没有找以前的关系,包括北京高层,而是依照《信访
条例》一步一步地来。
从“死亡状态”醒来的陆德明,2005年10月第一步向上海市公安局杨浦分局申诉,
第二步向上海市公安局申诉。但是,两级公安采取了相通的态度,不但不改变原来的定
论,而且在原来基础上“锦上添花”,尽量把它描绘成铁案。无法容忍事实与认定的巨
大出入和与法律依据相悖,陆德明第三步又向上海市委、市政府信访办申诉。其实,在
好多地方,人们都把信访办称邮局,只会转信,而无力解决问题。然而,这么个常识,
陆德明却不知道。直到信访办的人对究竟12日还是15日搞不清,就说“不算1号,不算
30号,就15号吧”和“我没有接你电话的义务,你要(指信访处理的回单)吗?不要,
就撕掉”,根本惹不了公安局时,才感觉暗无天日。
事实上,这起轰动全国乃至全世界的“教授嫖娼”事件,并不难搞清,只要有关的
机关和部门认真负责,而不是推诿扯皮甚至不作为,很容易。在这起事件中,至少有两
点疑问:
第一,“嫖娼结论”与事实不符。对方女孩,陆德明是作为异性朋友接触的,根本
不知道她是“小姐”。当时,陆德明见她没有工作,生活很困难,就接济了她一些。又
由于自己的婚姻早已有了危机,这时有个女孩闯入,最终出现了陆德明称为“性道德错
误”的错误,难道不值得理解和原谅吗?恋爱和婚姻,人的基本权利和自由。一个人,
当婚姻名存实亡,就不可以对别的女子产生好感并相处?可是,杨浦分局殷行派出所的
办案人员尽管没有抓到他们“现行”,且已经事隔半年多,还是认定为“嫖娼”。
不仅如此,就连办案人员的取证手段还涉嫌违法呢!“严禁用yy、欺骗等手段非法
收集证据,用非法手段收集的证据不得作为定案处罚的依据”,应该说是每一位执法者
的最起码的常识。可是,审理陆德明的这几个人,当陆德明澄清是2004年1月寒假里与
那女孩有过接触,然后就再也没找过时,他们竟咬定2月,似乎与那女孩交往的不是陆
德明而是他们,并且说“这不重要,无所谓。”一个学者,半辈子和学生打交道了,见
那阵势一时不方寸大乱,才怪?
第二,处罚没有法律依据。当时尚在施行的《治安管理处罚条例》第十八条明确规
定“违反治安管理行为在六个月内公安机关没有发现的,不再处罚”。也就是说,即便
嫖娼了,但六个月内公安机关没有发现,而六个月后发现了,也不能处罚。陆德明,住
“锦雪园”宾馆的时间,与杨浦公安《处罚决定书》的日期,整整差了六个多月。更何
况,人家是不是嫖娼都有待商榷。
而今,复旦校园内少了一个活跃的身影,莘莘学子们听不到他的课了。有媒体曾经
引用一名本科女生的话说,“陆德明是个好老师,很为学生着想,他上课思路清晰,思
维很活跃”。又众所周知,早在1993年陆德明就已功成名就;因对“后发展经济学”和
“当代中国经济发展”颇有研究,一直享受着国务院特殊津贴(不知道现在还享受没有
,否则怎么生活?);从2001年开始便是上海市政府的决策咨询专家,还是云南省政府
经济顾问,建设银行、民生银行和上海市工商行政管理局等咨询专家委员;香港——上
海发展联合研究所所长等;在学院内部,给本科生讲《发展经济学》,给在职研究生讲
《当代中国经济研究》,给博士生讲《社会主义经济理论专题》......就在被警方和学
校曝光的前几天,还就央行加息一事接受《华尔街日报》的采访,“中国用加息来减轻
需求压力是正确的做法”。
(图为陆德明在作演讲 )
就是这样一位对国家和人民有重大回报的人物,在他的婚姻出现危机时,组织和社
会非但没有替他分忧,反而把他个人私德的问题归结到“嫖娼”和上升到“道德败坏”
。对此,无论怎么把陆德明往坏想,我都看不到这是一个天天高喊“尊重知识”和“建
设创新型国家”的人们的明智之举。
(有声援陆教授者,请发信至y***********[email protected],但是有意炒做的媒体
不在欢迎之列)
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e*s
2
因为要去加拿大开会,需要返回美国的签证,可是无法找到美国驻加拿大使馆的签证预
约时间的信息,好像是必须预约签证交费之后才可以看到预约时间。
因为时间比较紧,如果找不到合适的签证时间,可能就不去加拿大了,所以也不想浪费
签证费。
哪位知道如何看到签证预约的时间呢?或者谁已经交了签证费,应该可以查到签证预约
时间,麻烦帮忙查一下,多谢了!需要是签证时间是12月7号左右,签证地点是
Montreal, Canada,签证类型是H1B
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s*n
3
M-CSF培养的bone marrow macrophage,stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
/STAT1,其他两个都blot的很好,但是pAKT总是没有想要的带,貌似出来的带都是二抗
结合的非特异性带。
请问版上高人,有blot过pAKT的没有?能否帮我看看问题出在什么地方了啊?
我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20,
BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
一抗就dilute在blocking buffer里边。
protocol:
室温block 1h,一抗4度过夜,洗3次×10min;二抗室温30min,洗3次×15min。
我初步怀疑是tween 20量加多了,又看到班上有用pbs做washing buffer的,貌似pbs更
温和一些,不知道用pbs会不会好一些?
小女子多谢了先!
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C*S
4
陆教授,这事简单,让那个“小姐”写个证明材料。否则,这种事情说不清。
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F*u
5
去travel置顶查automatic visa revalidation的信息
很可能你不需要有效美签也可以返美

【在 e*s 的大作中提到】
: 因为要去加拿大开会,需要返回美国的签证,可是无法找到美国驻加拿大使馆的签证预
: 约时间的信息,好像是必须预约签证交费之后才可以看到预约时间。
: 因为时间比较紧,如果找不到合适的签证时间,可能就不去加拿大了,所以也不想浪费
: 签证费。
: 哪位知道如何看到签证预约的时间呢?或者谁已经交了签证费,应该可以查到签证预约
: 时间,麻烦帮忙查一下,多谢了!需要是签证时间是12月7号左右,签证地点是
: Montreal, Canada,签证类型是H1B

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h*o
6
pAKT antibody from cell signaling works great for me
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c*t
7
活该
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e*s
8
我应该用不了automatic revalidation,因为我已经从F1转成H1B签证,而且H1B从来没
有签过

【在 F*********u 的大作中提到】
: 去travel置顶查automatic visa revalidation的信息
: 很可能你不需要有效美签也可以返美

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b*i
9
Depending on your stimuli, p-Akt may not be high enough. Another trick, use Femto, not Pico, to develop
your membrane. This issue is about how much p-Akt in your system, but not Ab issue.

ERK

【在 s********n 的大作中提到】
: M-CSF培养的bone marrow macrophage,stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
: /STAT1,其他两个都blot的很好,但是pAKT总是没有想要的带,貌似出来的带都是二抗
: 结合的非特异性带。
: 请问版上高人,有blot过pAKT的没有?能否帮我看看问题出在什么地方了啊?
: 我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20,
: BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
: 一抗就dilute在blocking buffer里边。
: protocol:
: 室温block 1h,一抗4度过夜,洗3次×10min;二抗室温30min,洗3次×15min。
: 我初步怀疑是tween 20量加多了,又看到班上有用pbs做washing buffer的,貌似pbs更

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h*s
10
那也没关系,一样可以用。
[在 ets (ETS) 的大作中提到:]
:我应该用不了automatic revalidation,因为我已经从F1转成H1B签证,而且H1B从来
没有签过

:...........
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y*i
11
听起来是一抗质量问题。

ERK

【在 s********n 的大作中提到】
: M-CSF培养的bone marrow macrophage,stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
: /STAT1,其他两个都blot的很好,但是pAKT总是没有想要的带,貌似出来的带都是二抗
: 结合的非特异性带。
: 请问版上高人,有blot过pAKT的没有?能否帮我看看问题出在什么地方了啊?
: 我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20,
: BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
: 一抗就dilute在blocking buffer里边。
: protocol:
: 室温block 1h,一抗4度过夜,洗3次×10min;二抗室温30min,洗3次×15min。
: 我初步怀疑是tween 20量加多了,又看到班上有用pbs做washing buffer的,貌似pbs更

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e*s
12
请问你是这样用过吗?有没有官方的链接有具体说明的,我没有找到我这种情况的。多
谢!

【在 h****s 的大作中提到】
: 那也没关系,一样可以用。
: [在 ets (ETS) 的大作中提到:]
: :我应该用不了automatic revalidation,因为我已经从F1转成H1B签证,而且H1B从来
: 没有签过
: :
: :...........

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s*s
13
cell signaling的pAKT(473) antibody应该没有问题
有可能的问题
1.抗体坏了
buy new antibody
2.收细胞的过程中dephosphorylation了
A.adding phosphatase inhibitor in your lysis buffer and do everything
quick on ice
B.终极解决方案
do duplicate plates
one plate is used for normalizing protein concentration
another plate directly lyzed with sampling buffer, in this way, you can
preserve all phosphorylation

ERK

【在 s********n 的大作中提到】
: M-CSF培养的bone marrow macrophage,stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
: /STAT1,其他两个都blot的很好,但是pAKT总是没有想要的带,貌似出来的带都是二抗
: 结合的非特异性带。
: 请问版上高人,有blot过pAKT的没有?能否帮我看看问题出在什么地方了啊?
: 我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20,
: BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
: 一抗就dilute在blocking buffer里边。
: protocol:
: 室温block 1h,一抗4度过夜,洗3次×10min;二抗室温30min,洗3次×15min。
: 我初步怀疑是tween 20量加多了,又看到班上有用pbs做washing buffer的,貌似pbs更

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F*u
14
我这么做过 没问题
travel版置顶有说明

【在 e*s 的大作中提到】
: 请问你是这样用过吗?有没有官方的链接有具体说明的,我没有找到我这种情况的。多
: 谢!

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s*n
15
请问您的protocol和buffer都和我有什么不一样的么?
我用100u/ml IFN beta stimulated, 对macrophage绝对应该能让AKT磷酸化了啊。

【在 h*******o 的大作中提到】
: pAKT antibody from cell signaling works great for me
avatar
s*n
16
我用100U/ml IFN beta stimulte的,应该会诱导大量pAKT的啊。

use Femto, not Pico, to develop
Ab issue.

【在 b********i 的大作中提到】
: Depending on your stimuli, p-Akt may not be high enough. Another trick, use Femto, not Pico, to develop
: your membrane. This issue is about how much p-Akt in your system, but not Ab issue.
:
: ERK

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b*l
17
有 positive control 么?

ERK

【在 s********n 的大作中提到】
: M-CSF培养的bone marrow macrophage,stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
: /STAT1,其他两个都blot的很好,但是pAKT总是没有想要的带,貌似出来的带都是二抗
: 结合的非特异性带。
: 请问版上高人,有blot过pAKT的没有?能否帮我看看问题出在什么地方了啊?
: 我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20,
: BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
: 一抗就dilute在blocking buffer里边。
: protocol:
: 室温block 1h,一抗4度过夜,洗3次×10min;二抗室温30min,洗3次×15min。
: 我初步怀疑是tween 20量加多了,又看到班上有用pbs做washing buffer的,貌似pbs更

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j*r
18
You might just set up a positive control (like any cultured fibroblasts
or epithelial cells, starved of serum then treated with serum or other
defined factors for short time).
If you have no problem with pMAPK or pStat3, as other already pointed
out, pAkt in your cells might be too low to be detected.
By the way, how does IFN-beta activates PI3K or Akt? Thanks

【在 s********n 的大作中提到】
: 请问您的protocol和buffer都和我有什么不一样的么?
: 我用100u/ml IFN beta stimulated, 对macrophage绝对应该能让AKT磷酸化了啊。

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s*n
19
IFNAR1 dependent pi3k activation,具体signaling pathway不知道。
多谢大侠指点!

【在 j********r 的大作中提到】
: You might just set up a positive control (like any cultured fibroblasts
: or epithelial cells, starved of serum then treated with serum or other
: defined factors for short time).
: If you have no problem with pMAPK or pStat3, as other already pointed
: out, pAkt in your cells might be too low to be detected.
: By the way, how does IFN-beta activates PI3K or Akt? Thanks

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h*n
20
which p-akt antibody are you using now?
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