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一个提质粒时遇到的问题向大牛请教

一个提质粒时遇到的问题向大牛请教# Biology - 生物学

d*g2013-05-20 07:05

1 楼

最近比百度还难过的就是苹果。跌！跌！跌！20年史无前例，苹果股价14天持续暴
跌，8天蒸发超5000亿。与最高峰相比，苹果15000亿人间蒸发！
跌，止都止不住
4月27日苹果发布2016第一季度财报，这是苹果13年以来交出的最差成绩单，营收
创下13年来首次下滑，净利润暴跌22%！公布后苹果股价瞬间暴跌8%，1小时蒸发2600多
亿！
事情并没有就这样结束了，在随后的日子里，苹果更是创造了20年来最长的8连跌
，8天蒸发5139亿，最低跌至91.85美元，创下近2年来新低，过去4年苹果的涨幅全部付
之东流！
苹果这次这么惨的一项重大原因，便是苹果在中国大陆、台湾、香港的营收暴跌26
%，这是苹果营收自2003年以来首次下滑！iphone、ipad、Mac，三款核心产品全部骤降！
惨败，被华为碾压
刚刚，2016年第一季度中国智能手机市场份额数据出炉，华为以15.8%登顶拿下第
一，OPPO第二，小米第三，Vivo第四，苹果仅为第五！苹果持续下滑，国产品牌一路飙
升，今天这一刻是值得载入历史的！
今天还有一个消息让所有华人扬眉吐气，国家知识产权局最新公布，去年华为向苹
果许可专利769件，而苹果向华为许可专利仅有98件！据估算苹果每年至少向华为支付
数亿美元的专利费。惊天逆转，这一刻也是值得载入历史的！
从2011年到2015年，苹果在中国一路高歌猛进，其中一半的功劳将归功于中国，
2014年最后一季度，中国正式成为苹果最大的消费市场，中国区的销量达到了苹果总共
的35%，比本土美国还高。

s*x2013-05-20 07:05

2 楼

最近制备了一批～20 constructs，中提QIAGENT试剂盒制备，其中有2个construct在小
提时没有任何问题，但是一到中提时就产量巨低-低到几乎没什么DNA。
换了几个克隆，试过中提和大提都产量巨低。
我用的是TOP10的菌种，后来换了DH5alpha和Stella cell，或用Chl+增加copy number
都不好用。
以前也遇到类的问题，当时就是摇了大量的菌，DNA量总算够了，但是struggle了好些
天。
想请教一下大牛这个到底是什么问题，为什么小提时没问题，中提大提时就产量低。具
体可能是什么原理？有什么解决方法。万分感谢。

t*22013-05-20 07:05

3 楼

正常

b*82013-05-20 07:05

4 楼

我以前也碰到过这个问题，你那个产量低的vector是什么？
我曾经碰到两个质粒，一个是基于pECE的表达质粒，另一个是用pMir-reporter 做的一
个基因的3‘UTR报告基因质粒，这两个质粒做midiprep的产量每次最多只有30ug，换感
受态都不行，老板还总以为是我自己的问题，后来换了别的人提，也是同样的问题

Z*a2013-05-20 07:05

5 楼

这傻叉得有多恨果子，连我这果黑都看不下去了

s*y2013-05-20 07:05

6 楼

小提和中大提的培养液量不同，生长曲线不一样。
建议要么在中大提培养的时候增加抗生素用量，要么你就摇上１０～２０个小提的管，
然后合在一起做中提

number

【在 s********x 的大作中提到】

: 最近制备了一批～20 constructs，中提QIAGENT试剂盒制备，其中有2个construct在小
: 提时没有任何问题，但是一到中提时就产量巨低-低到几乎没什么DNA。
: 换了几个克隆，试过中提和大提都产量巨低。
: 我用的是TOP10的菌种，后来换了DH5alpha和Stella cell，或用Chl+增加copy number
: 都不好用。
: 以前也遇到类的问题，当时就是摇了大量的菌，DNA量总算够了，但是struggle了好些
: 天。
: 想请教一下大牛这个到底是什么问题，为什么小提时没问题，中提大提时就产量低。具
: 体可能是什么原理？有什么解决方法。万分感谢。

s*s2013-05-20 07:05

7 楼

//nod
中提和接种方法很有关系。要么就是多摇点tube

【在 s******y 的大作中提到】

: 小提和中大提的培养液量不同，生长曲线不一样。
: 建议要么在中大提培养的时候增加抗生素用量，要么你就摇上１０～２０个小提的管，
: 然后合在一起做中提
:
: number

s*y2013-05-20 07:05

8 楼

对，你说的非常好。关键就是这个接种方法不同。小提一般都是从板上的菌点接种，
而中提是在已经长起来的液体里接种。
其实在板上长的时候因为菌落里面有那个biofilm, 所以只要最底下一层是有抗性的携
带质粒的菌，顶上肯定也就是。而且零星长起来的突变抗性菌没有办法跑过去占他们的
地盘，所以菌种比较单纯。但是在摇的菌液里情况就完全不一样了，突变体很快就能取
代携带质粒的菌体，因为携带质粒其实对于细菌而言就和我们被感染了寄生虫是类似的
，都是个负担。
有一个小窍门就是把一个单克隆挑出来在板上满满的涂一大圈，然后长起来后把整层都
刮下来放到培养液里去再摇个８小时就可以做中提了。

【在 s******s 的大作中提到】

: //nod
: 中提和接种方法很有关系。要么就是多摇点tube

q*72013-05-20 07:05

9 楼

You can try this company's Ultrapure Midi and Maxi which generate ultrapure
plasmid DNA and is much cheaper than Qiagen kit.
http://www.greenbioresearch.com/midi-maxi-ultrapure-plasmid-ext

B*n2013-05-20 07:05

10 楼

说一点我的经历，或许对楼主有帮助
我去年也在大提pLKO质粒遇到同样的问题，产量很低。因为当时有人警告我说这个质粒
拷贝数很低要摇很多菌，所以我先挑一个单菌落放在5ml培养基里过夜摇，然后转到1L
的大瓶里放大。结果很悲惨。
后来发现没那么邪乎，直接挑一个单菌落放在250ml过夜摇就能提到1-2mg。
我建议：
1.每次都重新转化感受态
2.不要经过小摇，直接单菌落接种

z*i2013-05-20 07:05

11 楼

这种情况我也遇到过很多次。小提的时候一点问题都没有，中提的时候什么都没有，哪
怕是用250ml也提不出来。我一般都是重新转化，或者划平板，挑单克隆。就向楼上说
的一样。

L*t2013-05-20 07:05

12 楼

Amp抗型的bla基因是分泌型beta内酰胺酶, Studier的文章里提到过菌液OD=0.2-0.3的
时候培养基里的Amp已经没有了，补加也会马上被消化掉，唯一的办法是把菌液离心后
用新培养基重旋，否则肯定会掉质粒。

【在 s******y 的大作中提到】

: 对，你说的非常好。关键就是这个接种方法不同。小提一般都是从板上的菌点接种，
: 而中提是在已经长起来的液体里接种。
: 其实在板上长的时候因为菌落里面有那个biofilm, 所以只要最底下一层是有抗性的携
: 带质粒的菌，顶上肯定也就是。而且零星长起来的突变抗性菌没有办法跑过去占他们的
: 地盘，所以菌种比较单纯。但是在摇的菌液里情况就完全不一样了，突变体很快就能取
: 代携带质粒的菌体，因为携带质粒其实对于细菌而言就和我们被感染了寄生虫是类似的
: ，都是个负担。
: 有一个小窍门就是把一个单克隆挑出来在板上满满的涂一大圈，然后长起来后把整层都
: 刮下来放到培养液里去再摇个８小时就可以做中提了。

l*12013-05-20 07:05

13 楼

mark.

【在 L*****t 的大作中提到】

: Amp抗型的bla基因是分泌型beta内酰胺酶, Studier的文章里提到过菌液OD=0.2-0.3的
: 时候培养基里的Amp已经没有了，补加也会马上被消化掉，唯一的办法是把菌液离心后
: 用新培养基重旋，否则肯定会掉质粒。

s*v2013-05-20 07:05

14 楼

Can you just stop posting this bullshit everywhere?

ultrapure

【在 q***7 的大作中提到】

: You can try this company's Ultrapure Midi and Maxi which generate ultrapure
: plasmid DNA and is much cheaper than Qiagen kit.
: http://www.greenbioresearch.com/midi-maxi-ultrapure-plasmid-ext

m*e2013-05-20 07:05

15 楼

非常同意这位仁兄的看法，对于Amp抗性菌，先小量摇菌再扩大培养是下策

【在 s******y 的大作中提到】

p*i2013-05-20 07:05

16 楼

Carbenicillin 会有帮助吗？

【在 L*****t 的大作中提到】

H*i2013-05-20 07:05

17 楼

CB只是稳定/难降解一些，但对AmpR/Bla没区别，这个问题的关键AmpR/Bla是个分泌蛋
白，而且只有分泌了才产生抗性
我有时候做克隆有意避免使用Amp。。

n*e2013-05-20 07:05

18 楼

我用50ml的培养液，不知道是中提还是大提。我直接从板上挑单克隆进入50ml，
overnight，产量500-1000ug

m*z2013-05-20 07:05

19 楼

说清楚，小提的箘液跟中提的是同一瓶箘液吗？
如果不是同一瓶，那可能是小提的箘液长过了amp失效
直接划板挑单菌落到100-250ml培养过夜就没有问题了。

number

【在 s********x 的大作中提到】

s*n2013-05-20 07:05

20 楼

如果lz是bla抗性基因的话这个解释最靠谱

【在 L*****t 的大作中提到】

L*t2013-05-20 07:05

21 楼

wolfson.huji.ac.il/expression/local/bacteria/studierautoinduced.pdf‎
附上Studier原文的链接，这篇文章推荐大家都看看，就算不是做原核表达的也有很多
有用的信息：
1. bla蛋白导致amp失效的问题，这个之前说过了。
2. Kan抗性在高磷酸盐条件下不能用来做筛选，除非把卡那霉素用量增加2-4倍
3. 限制摇瓶生长密度的主要是镁离子和供氧
如果问题集中出现在个别construct上的话还有一种可能就是蛋白毒性很强，超微量的
表达都有可能导致溶菌。（有没有原核Promoter不是决定性因素，pLysS里面的T7溶菌
酶方向反了，但是正好能提供稳定微量表达不到致死量的蛋白）

【在 s********n 的大作中提到】

: 如果lz是bla抗性基因的话这个解释最靠谱