颠覆性创新：郑永唐/欧阳松应/姜世勃研发成功一个作用于多肽药物靶点—HR1的高效广谱抗新冠候选疫苗

2022-11-11 22:11

2022年11月10日，中国科学院昆明动物研究所郑永唐研究员团队联合福建师范大学欧阳松应教授团队和复旦大学姜世勃教授团队在中国卓越领军期刊Cell Research（IF：46.297）上在线发表了题为“A variant-proof SARS-CoV-2 vaccine targeting HR1 domain in S2 subunit of spike protein（靶向刺突蛋白S2亚基HR1结构域的一种广谱新冠病毒疫苗）”研究论文（https://doi.org/10.1038/s41422-022-00746-3）。中国科学院昆明动物研究所庞伟副研究员、路莹博士生、沈帆硕士生和福建师范大学赵燕波博士生为共同第一作者，郑永唐研究员、欧阳松应教授和姜世勃教授为该论文共同通讯作者。

新冠病毒（SARS-CoV-2）自从2019年出现至今已在全世界大流行已长达3年，其全球大流行趋势仍未衰减。据世界卫生组织（WHO）统计，截至2022年11月6日，全球累计确诊新型冠状病毒感染病例为6.29亿例，累计死亡病例为658万例。目前虽然包括灭活全病毒疫苗、病毒载体疫苗、mRNA疫苗和重组蛋白亚单位疫苗等多种类型的新冠疫苗已在人群中大规模接种，但新冠病毒突变株，特别是奥密克戎（Omicron）等多种突变株的不断涌现，造成现有疫苗对新发突变株效价快速下降。因此，出现了接种多次疫苗后仍然发生大量“突破性感染”的现象，使当前新冠肺炎疫情防控仍然面临巨大挑战！但遗憾的是，至今尚无高效广谱新冠病毒疫苗获得临床应用。

新冠病毒的膜蛋白为刺头（S）蛋白，分为S1和S2亚单位。新冠病毒靠近靶细胞后，S1亚单位中的受体结合域（RBD）介导病毒与细胞表面受体结合，诱发S2亚单位发生空间构型变化，其N端的融合多肽（FP）扎入细胞膜内，其C端的七肽重复序列1（HR1）和2（HR2）相互作用，形成稳定的6螺旋（6-HB），将病毒膜和细胞膜拉在一起发生融合，促进病毒的基因通过融合空进入宿主细胞内进行复制。

在新冠病毒感染机体后，S1亚单位中的RBD在感染体内诱导产生主要的中和抗体。因此，第一代获批上市的新冠疫苗抗原中都含有可诱导针对疫苗株（即新冠病毒原始株）中和抗体的RBD。但新冠病毒变异株（特别是奥密克戎）的RBD序列中发生大量突变（可能是新冠病毒感染者体内的中和抗体的选择压力所致），得以逃避第一代新冠疫苗所诱导中和抗体的抑制作用。现有疫苗的接种虽可减少新冠病毒变异株感染者的重症发生率，但不能预防接种者被新冠病毒变异株感染，也不能防止其快速传播。因此，急需研发作用于新冠病毒S蛋白中高度保守免疫位点的广谱疫苗！

与S1亚单位不同， S2亚单位在感染细胞前被S1亚单位覆盖，其中的中和抗体位点不能充分暴露，所以在体内只能诱导很低水平的中和抗体。因此，一方面S2亚单位中的HR1和HR2区域在病毒与细胞结合的瞬间发生短暂的暴露，机体的免疫系统对其选择压力较小，其序列在所有冠状病毒中均较为保守。另一方面，很难模拟其在暴露瞬间所形成的空间构型，为针对该靶点研发新冠疫苗带来严峻的挑战。所以，目前在国际上尚无任何针对S2亚单位新冠疫苗的报道。

HR1和HR2是2个令人爱恨交加的抗I型包膜病毒药物和疫苗的靶点！早在30年前，当时在纽约血液中心工作的姜世勃研究员设计和合成了衍生于HIV-1 gp41 HR1和HR2区的多肽来研发艾滋病疫苗，却发现它们的抗血清没有任何中和作用。但意外地发现HR2多肽能高效地抑制HIV与宿主细胞的融合，并阻止病毒入侵宿主细胞（Nature 1993），其专利转让给美国Trimeris药物公司开发出世界上第一个靶向HR1的多肽药物——恩夫韦肽（俗称T20）。姜世勃团队后来又开发出抗SARS多肽（Lancet 2004）、抗MERS多肽（Nat Commun 2014）、抗COVID-19的多肽（Cell Res 2020）、和冠状病毒通用抑制多肽—EK1（Sci Adv 2019）。EK1多肽现正在临床试验中（详见本公众号在2022.01.28和2022.08.12的两篇报道）（https://mp.weixin.qq.com/s/eHJamVoi7e7Y8VfvY8v_GQ

https://mp.weixin.qq.com/s/JREtvMm-EMZBOBPiLziRVg）。

既然HR2多肽能够和病毒的HR1区结合阻止HR1/HR2六聚体的形成而抑制病毒融合，那么HR1多肽是否也可以与病毒的HR2区结合阻止六聚体的形成而抑制病毒融合？但结果出乎意料，HR1多肽的确能与病毒的HR2区结合阻止六聚体的形成，但其抗HIV的活性只有HR2多肽的千分之一。其主要原因是HR1多肽含有太多的酸性氨基酸，其水溶性很差，在生理盐水中不能形成稳定的三聚体，而是多聚体。因此，姜世勃团队用细菌的foldon（Fd）蛋白设计出HR1-Fd三聚体，发现其抗病毒活性比HR1多肽要高出上千倍（JBC 2010）。他们立即尝试加上人的IgG Fc设计出HR1-Fd-Fc三聚体来研发HIV疫苗，发现其免疫血清的确有低水平的中和作用（BBRC 2010）。后来，姜世勃团队使用类似策略来研发抗SARS、MERS、和新冠肺炎的疫苗，均告失败。

2008年，中科院微生物研究所田波院士与中科院昆明动物研究所郑永唐研究员联合培养的庞伟博士生根据HIV-1 gp41的HR1和HR2序列设计和表达了HR121蛋白，发现三分子的HR121形成1个HR1/HR2六聚体连接1个HR1三聚体（图1），该HR1三聚体与HR1-Fd三聚体一样能与病毒的HR2区形成六聚体，抑制HIV-1的融合和入侵宿主细胞（Virology, 2008；J Biomol Screen 2011）。

图1. 基于HIV-1 gp41 HR1和HR2序列设计的HR121蛋白抑制剂

在新冠疫情暴发以后，郑永唐研究员团队根据新冠病毒S2亚单位的序列设计了HR121蛋白（图2a），可在大肠杆菌中以可溶形式大量表达，通过Superdex 200一步纯化后，蛋白（~22 kDa）得率为每升菌液10-20mg。他们发现HR121蛋白的确能有效地抑制新冠病毒与宿主细胞融合，阻止病毒入侵宿主细胞。但他们非常意外地发现其抗血清也具有很强的中和作用。他们发现新冠病毒的HR121蛋白和HIV-1的HR121蛋白一样形成HR1/HR2六聚体-HR1三聚体，其诱导的抗体能够与病毒的HR1三聚体结合，抑制病毒的融合/入侵。但奇怪地是使用还原性电泳分析证明HR121蛋白是二聚体，而不是三聚体（图2b）。福建师范大学欧阳松应教授团队解析了HR121蛋白的晶体结构，证实HR121的确是二聚体，即由2个HR121分子形成4个HR1和2个HR2组成的6螺旋结构（图2c-d）。

图2. 基于新冠病毒S2亚单位HR1/HR2序列的HR121疫苗的设计

（a）HR1和HR2氨基酸序列和HR121疫苗氨基酸序列组成；(b) 蛋白电泳图；(c-d) HR121蛋白结晶的正面和反面图。

因此，他们推测HR121二聚化后，形成4个平行的HR1和2个反平行的HR2组成的6螺旋结构。其表面未结合HR2的HR1分子形成2个凹槽可作为抗原表位，模拟其在膜融合中间态的构象。因此，可诱导产生针对HR1的高效广谱中和抗体，抑制其自身蛋白HR121或病毒膜融合中间态中HR1三聚体和HR2结合，从而阻断膜融合过程和病毒进入细胞（图3）。

图3. HR121疫苗诱导广谱中和抗体的作用机制

研究发现，HR121疫苗免疫新西兰大白兔后，可在体内诱生针对新冠病毒原始毒株及其23个主要突变毒株的高效广谱中和抗体，可中和包括目前广泛流行的新冠病毒奥米克戎亚谱系BA.1、BA.2、BA.3、BA.4和BA.5的感染（图4）。

图4. HR121疫苗在兔子体内诱导了广谱中和抗体

用HR121 疫苗免疫ACE2人源化小鼠后，诱导产生了高滴度结合抗体和中和抗体；新冠病毒攻毒免疫ACE2人源化小鼠后，通过新冠病毒的亚基因组RNA检测，发现HR121免疫小鼠中没有复制活性的病毒存在，而且相关的肺组织炎症因子活化降低，肺组织无病理改变。对照小鼠则呈现为新冠病毒感染的高水平病毒复制和典型间质性肺炎病变特征。

图5. HR121疫苗保护hACE2小鼠免受新冠病毒感染

HR121疫苗免疫金黄地鼠后，无论在免疫后14天或3个月攻毒，结合抗体滴度和中和抗体滴度均分别保持在10⁴和10²左右；其抗血清能有效地抑制新冠病毒活病毒的感染；新冠病毒攻毒后，在HR121免疫的地鼠肺部中检测不到有复制活性的病毒，肺组织也无病理变化。

图6. HR121疫苗保护金黄地鼠免受新冠病毒感染

HR121免疫接种猕猴后，结合抗体滴度和中和抗体滴度分别达到在10⁵和10³左右。HR121诱导了针对目前主要新冠病毒突变株的广谱中和抗体，包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Lambda、Mu、及Omicron亚谱系 BA.1、BA.2、BA.3和BA.4/5。

新冠病毒攻毒HR121免疫猕猴后，在鼻拭子和咽拭子中连续7天检测不到有复制活性的病毒。攻毒7天后安乐死解剖猕猴，在肺组织中也未检测出活病毒，肺组织病理变化轻微。攻毒对照组猕猴则表现为肺部高病毒载量和典型肺部病变特征，肺组织病理主要表现为淋巴细胞聚集，增厚的气管壁，肺泡破坏和肺泡内出血。

图7. HR121疫苗保护猕猴免受新冠病毒感染

为检测HR121疫苗对奥密克戎突变株的保护性，研究人员将HR121分别与弗氏佐剂和铝佐剂混合，免疫金黄地鼠后，发现含有不同佐剂的HR121疫苗均可诱生较高滴度的结合抗体和中和抗体。新冠病毒Omicron BA.2攻毒HR121免疫地鼠，发现这2种佐剂的疫苗诱生的免疫反应均可降低地鼠肺部的病毒载量4 个Log值左右，其肺组织也无病理改变。