6+免疫热点趋化因子套路拆解！新鲜文献教你零代码复现

各位小伙伴大家好，我是灰灰，本期复现的文献所涉及的是备受高分杂志关注的热点方向——趋化因子，这篇文章是2022年7月发表在影响因子6+医学杂志Am J Cancer Res上生信文章~

趋化因子也称为趋化性细胞因子，是一类小分子（8到10 kDa）分泌性蛋白，由于它们具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力，因而命名为趋化因子。其功能主要是在稳态和炎症状态下指导细胞迁移，即表达趋化因子受体的细胞向趋化因子高浓度的区域迁移。目前趋化因子根据位于 N 末端的保守半胱氨酸残基的数量和位置，将这些蛋白分为四个亚家族：C 趋化因子，CC 趋化因子，CXC 趋化因子和 CX3C 趋化因子亚家族，所有这些蛋白都通过与趋化因子受体相互作用来发挥其生物学效应。在不同类型的趋化因子中，CXC趋化因子在肿瘤发生中的作用最为显著。

尽管目前发现一些趋化因子/趋化因子受体（CCRs）在胃癌（GC）中存在差异表达，且其表达与不良预后的相关，但大多数CCRs在GC进展中的作用尚未见报道。因此，当前研究中作者首先分析了CCRs突变的特征并筛选差异表达的CCRs，通过GO功能注释和KEGG通路分析，探讨其潜在的生物学功能；通过多因素Cox回归分析，构建预测模型并绘制列线图来评估胃癌患者的预后。此外，作者对高、低风险组胃癌患者也进行GSEA和GSVA分析，并分析了风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性。

PS：原文中作者并没有详细描述63个CCRs的来源，这里以文献A guide to chemokines and their receptors[PMID: 29637711]中的64个CCRs进行复现。

• 差异表达

• Figure 1：TCGA-STAD数据集中CCRs突变情况

• Figure 2：TCGA-STAD数据集中CCRs的表达水平

• Table 1：Top 24 CCRs的表达

• Figure 6：ACKR3、CCR3和CCL21的免疫组化和qPCR分析

• 功能聚类

• Figure 3：top 24 CCRs的富集分析

• 临床意义

• Figure 4：CCRs对胃癌患者的预后价值

• Table 2：构成预后模型的四种CCRs

• Figure 5：预后风险模型的列线图

• Table 3：胃癌患者的总生存期进行单因素分析

• Table 4：胃癌患者的总生存期进行多因素分析

• Figure 7：风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性

• Figure 8：不同危险组的不同信号通路富集

• 使用工具

仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/)

GSCA数据库(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/)

Networkanalyst数据库(https://www.networkanalyst.ca/)

metascape数据库(http://metascape.org/)

HPA数据库 (https://www.proteinatlas.org/)

TIMER数据库 (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)

• 复现步骤

Figure 1：TCGA-STAD数据集中CCRs突变情况

PS：原文Figure 1突变分析涉及maftools包，这里感兴趣代码的小伙伴可以参考阿琛老师的推文《想让文章拥有如此漂亮的患者突变可视化图？“maftools“包帮你解决》进行学习，这里我们借用GSCA数据库进行复现

待分析完成后可得到胃癌中趋化因子的突变概况图和突变Top10的瀑布图，点击右上方红色下载图标即可下载PDF图片

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点击结果情况下方的表格下载，即可得到CCRs的在胃癌以及正常组织中的表达均值等

点击数据下载栏中的百度云超链接，即可下载TCGA-STAD的TPM格式的RNAseq数据。

提取64个CCRs基因的表达矩阵如下：

选择物种H.sapiens(human)，Data type为Microarray data，ID type为Official Gene Symbol，Gene-level summarization为Mean，上传整理好的CCRs表达矩阵，点击Submit，运行完成后点击右下方proceed

弹出的界面默认相关参数，点击Submid，运行完成后点击右下方proceed

点击Download即可下载得到差异分析结果

提取LogFC和P-value，与Figure 2中步骤(1)下载的CCRs的在胃癌以及正常组织中的表达均值汇总，即可得到文中Table 1

进入仙桃学术工具，点击左侧导航栏中的功能聚类（圈）→ GOKEGG(联合logFC)→圈图，点击上方刚刚分析好的云数据，基本参数输入显示的GO/KEGG富集条目，点击确认保存即可得到GO/KEGG富集分析圈图

PS：这里也可以选择柱状图、气泡图、弦图

弹出的结果界面中，Figure2和Figure 3分别为文中Figure3C和Figure3D，点击PDF图标即可下载图片，也可下载CYS格式，随后在cystocope中进一步美化

Figure 4：CCRs对胃癌患者的预后价值

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/)，左侧导航栏中选择基础绘图中的森林图→上传步骤(1)中得到的单因素结果，默认其它参数，点击确认，即可得到得到单因素的森林图

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/)，左侧导航栏中选择预后分析中风险因子图→上传Cox回归分析保存的Riskscore文件

默认相关参数，点击确认，即可得到文中Figure 4中的风险因子图

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/)，左侧导航栏中选择表达差异（挑）中复杂热图（上传）→上传Cox回归模型中CCRs的表达矩阵，同时按照RiskScore进行中位数将其分为高低风险组，默认其它参，点击确认，即可得到文中高低风险组表达热图

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/)，左侧导航栏中选择基础绘图中生存曲线-二分类/数值/单组→上传Cox回归分析保存的Riskscore文件

默认相关参数，即可得到文中高低风险组的预后生存曲线

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/)，左侧导航栏中选择基础绘图中时间依赖性ROC→上传Cox回归分析保存的Riskscore数据，预测年限调整为5年，默认其它参，点击确认，即可得到时间依赖性ROC

Figure 5：预后风险模型的列线图

PS：关于列线图模型的构建，一方面可以用Cox回归模型中CCRs的表达联合临床变量构建，另外也可以用Cox回归分析后得到的Riskscore联合临床变量

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/)，左侧导航栏中选择预后分析中[云]预后列线图→选择TCGA-STAD数据集，输入临床变量以及预后相关的CCRs，预测年限调整为1年、3年、5年，默认其它参，点击确认，即可得到预后CCRs的表达联合临床变量构建的列线图

点击下方数据下载里面原始临床数据+RNAseq编号对应的百度云超链接，下载相应的临床数据

提取相关临床变量，同时匹配Cox回归分析后得到的Riskscore列，最终整理格式如下

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/)，左侧导航栏中选择预后分析中预后列线图上传→上传整理好的上方数据，输入临床变量以及预后焦亡基因，预测年限调整为1年、2年、3年，默认其它参，点击确认，即可得到Riskscore联合临床变量构建的列线图

Table 3/4：胃癌患者的总生存期进行单因素/多因素分析

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/)，左侧导航栏中选择预后分析中单|多因素Cox回归-上传→上传列线图数据，默认其它参数，点击确认，即可得到各个变量在胃癌中的单因素/多因素Cox分析结果

Figure 6：ACKR3、CCR3和CCL21的免疫组化和qPCR分析

进入HPA(https://www.proteinatlas.org/)数据库，在检索栏输入基因ACKR3后点击Search

弹出界面分别选择Tissue和Pathology

Tissues选择STOMACH，即可得到文章中Figure 6A的Normal图片

CANCER选择STOMACH CANCER，即可得到文章中Figure 6B的Tumor图片，

同样操作步骤即可获取其它CCRs在胃癌和正常组织的免疫组化图

Figure 7：风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性

PS：原文中通过R包分析了风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性，这里我们也可以零代码替换成预后CCRs和免疫细胞的相关性

进入TIMER数据库 (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)，导航栏中选择Gene，Gene Symbol输入预后CCRs CXCR1，Cancer Types中输入STAD，Immune Infiltrates默认B cell，CD8+ T cell，CD4+ T cell，macrophage，neutrophil ，dendritic cell ，点击Submit，即可得到胰腺癌中焦亡基因CXCR1与多种免疫细胞的关系

Figure 8：不同危险组的不同信号通路富集

PS：对高低风险组进行的GSEA富集分析，这里可以重复利用Networkanalyst数据库对高低风险组进行差异分析（具体步骤可参见前方Table 1的复现内容），分析后提取所有基因及其对应的LogFC即可进行GSEA富集，这里我们以仙桃学术进行演示

进入仙桃学术工具，点击左侧导航栏中的功能聚类（圈）→GSEA富集分析，上传高低风险组差异分析结果中的所有基因及其对应的LogFC，默认其它参数，点击确认

进入仙桃学术工具，点击左侧导航栏中的功能聚类（圈）→ GSEA富集→GSEA可视化，点击上方刚刚分析好的云数据，基本参数输入显示的GSEA富集条目，点击确认保存即可得到GSEA图

PS：GSVA分析目前尚无法零代码完成，这里让我们期待一下升级版本的仙桃吧

好啦，以上就是本次趋化因子生信文献复现分享的全部内容啦，愿屏幕前的你学有所获，下期再见，886