【干货】细胞转染总是失败？用这个方法一次性搞定！

公众号新闻

2022-12-09 09:12

我在初出茅庐时做过一件令老板七窍生烟的事情：

用了大半管的脂质体法(价值2K人民币)在30瓶细胞中做转染，转染24小时后，显微镜下看，顿时傻眼了，为什么花费如此多的前期准备时间，俺的细胞转染率还这么低？低到完全不能用？

万念俱灰，最后无奈地把细胞全扔掉。然后我在当晚收获了一个这样的老板

话说回来，虽然旨在将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的细胞转染技术在经过了数十余年的发展后已成为了实验室工作中的基本方法了，然而细胞在实验中死活都不能转染成功的情况也因此成为了大家的日常呢。

或者又是遇到了转染操作对细胞的原始功能带来了扰动甚至于直接被干死，影响到了后续的实验，让你忍不住想对自己的细胞说一声

出现这种状况通常是涉及到两个问题：

1. 实验操作中的失误

2. 不同细胞转染技术的差异

常见的实验操作问题有：转染试剂跟细胞系不match、转染用的细胞已经传了”无数代”（俗称“太老了”）、不懂得把握转染时机、微生物污染、不同细胞之间交叉污染、抗生素太多杀死了细胞、转染时存在血清等影响因素、DNA不纯、转染用质粒中含有内毒素等

然而，有不少朋友在一一排查过后发现：自己并没有发生这些操作失误，可转染率甚至是细胞存活率依然不高，这究竟是为什么呢？

这就涉及到一个转染实验的核心问题：转染方法的选择。目前的转染技术大体来说可以分为三组：

1. 利用基因工程病毒的方法

2. 化学方法及依靠载体分子的方法

3. 物理方法及将核酸直接传递到细胞质的方法

然而，并非所有的转染方法都能适用于所有类型的细胞或实验，并维持良好的转染效率、存活率，同时不同转染手段在转染基因的表达水平等方面也有很大的差异。确定特定应用的最佳方法取决于几个因素，如细胞类型（原代细胞或细胞系）、细胞环境（体外、体内、原代）、转基因能力、安全性、所需效率、成本、时间等。

细胞转染方法类型如图所示：

化学法

化学方法是使用载体分子克服细胞膜屏障的转染技术。载体分子和核酸或任何细胞成分之间没有化学反应。转染原理包括带负电荷的核酸与带正电荷的载体分子（如聚合物或脂质）的相互作用，使核酸能够与带负电荷的膜成分接触，并通过内吞作用将基因掺入细胞中，然后将其释放到细胞中，并将其释放到细胞中细胞质。

常用的化学方法有：

DEAE-dextran法

磷酸钙转化法

亲脂试剂转染法

这些方法的优点在于操作的方便。然而缺点也是显而易见的，DEAE-dextran法、磷酸钙转化法的转染效率感人。且化学法依赖于细胞的增殖分裂，当细胞不分裂的时候，化学法就无法实现高效的外源基因递送。同时化学法面临着无法调和难题：

由于载体分子无法与细胞成分反应（无法被分解），其在体系内的驻留将导致明显的细胞毒性，这会降低诸如细胞活力测定实验的可信度。

不可否认化学法在部分的细胞系中表现还是可以的，但是在原代细胞的转染效率很差劲，尤其是在现在选择原代细胞做转染的比例越来越高的趋势下。这无疑削弱了化学法的可应用场景。

物理法

物理方法是通过物理或机械手段将核酸直接转移到细胞质或核中，而无需使用脂质等异物。

显微注射法通过注射DNA，mRNA和蛋白质来操纵单细胞，例如卵母细胞，也可用于将DNA转移到胚胎干细胞中以产生转基因生物。具有高精度高转化率的特点，但是操作难度大且昂贵，同时不适合大量的转染；

生物粒子递送法虽然快捷方便，但是有着极强的细胞毒性及死亡率；

电转法，可以转染大的DNA片段，并且在细胞系中的效率很好。对细胞和条件的要求宽松，能够转染几乎所有的细胞类型。

此外，随着CRISPR技术的普及，电转法被认为是适合转染这种技术体系的方法，利用电穿孔法进行原代细胞的基因编辑被各大实验室越来越多地广泛运用。

病毒转染法

一般来说，病毒转染法（特别是腺病毒）在原代细胞和细胞系中实现的转染效率很高。然而，大家必须记住：病毒转染法只能转染携带病毒特定受体的细胞类型。这使得其应用范围受限。

病毒感染周期的第一步是病毒和目标细胞表面的细胞受体之间的相互作用，导致病毒和细胞膜的融合。没有携带这种受体的细胞是不能被病毒感染的。病毒基因转移的其他局限性是生产载体费时费力，由于较高的生物安全水平要求，实验室成本升高，插入物大小的限制（大多数病毒载体为~10 kb，而非病毒载体能够达到~100 kb），如果转染的序列较大，加上报告基因等其他序列，在研究资金方面会显得捉襟见肘。同时病毒的感染效力会随着时间变化，同时具有免疫原性，妨碍了在体内的转化应用。

总体而言，在转染的难易程度和灵活性方面电转法有专长之处。

不同转染方式的对比

目前实验室里常用的是脂质体介导的细胞转染。然而，成功经验和失败经验到底哪个更多，大家都是做过实验的，不用我多说。

所以有条件的同学：何不尝试一下更换转染方法呢？

电转法作为一种通用、易用的细胞转染方法，具有二次开发的潜力，比如Nucleofector^TM 技术。1998年，Nucleofector^TM技术开发成功，并于2001年上市，是Lonza的第一个有效非病毒的用于原代细胞和难转细胞系的转染方法。

Nucleofector^TM技术是基于电脉冲在细胞膜上瞬间产生小孔，综合Lonza独创的转染体系，让核酸底物可以直接进入细胞核，使得细胞的转染效率最高有望可达99%^[1]，并使细胞转染不依赖于细胞的增殖分裂。这一不依赖细胞分裂的特性在用于转染一些不分裂的细胞非常的有效，例如（肝脏细胞，神经元细胞，心肌细胞等）。而传统的电转法和化学方法对这类细胞的转染效率极其低下。

figure1为Nucleofector^TM对比传统电转方法的效率；figure 2为Nucleofector^TM将DNA直接递送到细胞核内，使转染不依赖细胞的分裂。（数据来源：Nucleofector™ Technology产品手册）

上图为Nucleofector™的转染效率示意图（数据来源：Nucleofector™ Technology产品手册）

随着系统生物学与交叉学科方法的应用，要求细胞和系统模型越来越接近体内细胞的功能。这就意味着将来的细胞转染多数会是原代细胞的转染。而常用的传统化学法在转染原代细胞时成功率低。另外即使使用细胞系做为系统模型，传统方法也难重复出好的细胞转染效率与成活率。Nucleofector^TM技术着力于解决这个问题，无论是原代细胞、干细胞、还是细胞系，它都拥有很高的转染效率。

此外，电转法已是国际上常见的细胞转染方法。有多常见呢？我们可以从已经发表的paper中窥见答案。11月28日时在Google学术上搜nucleofector就能搜到足足3W6+paper！

这足以说明这种技术的在国际上的普及和受欢迎的程度。

这里引用下化学顶级综述杂志Chem Rev对Nucleofector^TM技术的评价：

“Nucleofector^TM技术是有史以来最流行的电转系统之一，于21世纪初问世，作为一种有效的细胞内递送方法迅速获得普及。”

此外，Nucleofector^TM技术还有着应用模块多、试剂盒包含细胞特异性缓冲液的特点。而且，其所属品牌Lonza还公开了600种以上常用细胞的转染数据和操作手册，可谓是非常的贴心了。

如果你对细胞电转法感兴趣，或者是想要了解更多提升细胞转染成功率的方法，欢迎扫描下方海报二维码，观看12月15日的专题直播——实验小白如何有效提高细胞转染率？也可扫描文末二维码：

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来源: qq

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