类器官重大进展！Cell子刊：复旦大学夏明宇团队成功建立首个具有功能性突触的耳蜗类器官，再现听觉单元早期发育！

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2023-02-02 12:02

用不了50年，人类将能用

生物工程的方法培育出人体的所有器官。

——诺贝尔奖获得者吉尔伯特

根据世界卫生组织的数据，全球有十分之一的人听力受损，这种致残性损伤影响着高达25%的老年人。在我国，每年新出生的耳聋婴儿有3万，其中60%的先天性耳聋由遗传因素引起，基因物质的改变最终导致耳蜗毛细胞的受损和缺失。目前，助听器和人工耳蜗是临床上常用的耳聋治疗手段，虽然可以帮助大部分耳聋患者获得部分听力，但二者对耳聋的恢复程度非常有限。因此，临床上急需可有效治疗先天性耳聋的药物。

如今类器官为疾病建模、药物发现和治疗策略制定提供了非常好的平台。目前研究人员已经从人或小鼠多能干细胞（iPSC）诱导出内耳类器官进行三维（3D）培养来进行疾病模拟和药物筛选。

近日，来自复旦大学医学神经生物学国家重点实验室的夏明宇团队首次通过分期3D共培养系统建立了具有功能外周听觉环路的耳蜗类器官，并通过一系列形态学和电生理学检测，证实了类器官内细胞和突触的功能，为感音神经性耳聋的研究提供了复合类器官研究平台。该研究题为“Generation of innervated cochlear organoid recapitulates early development of auditory unit”，发表在《Stem Cell Reports》杂志。

DOI:https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2022.11.024

由螺旋神经节神经元（SGN）支配的功能性耳蜗毛细胞（HCs）对于听力至关重要，但是目前仍然缺乏概括外周听觉回路的稳健模型。本研究中，作者在分期三维（3D）共培养系统中开发了具有功能性外周听觉回路的耳蜗类器官，首先重编程耳蜗祖细胞（CPC），这些增殖祖细胞是Wnt响应的LGR5支持细胞（SC），具有可长期扩展的增殖效力，然后逐步诱导人工耳蜗HC的分化，以及神经突从SGN的生长。

为了确定增强CPCs扩增的最佳条件，研究人员系统地筛选了在发育过程中靶向几种关键信号通路的因子，然后建立了提高CPCs自我更新能力的最佳实验条件。

为了进一步评估扩增培养基中每种组分对CPC增殖的需求，研究人员在第1天单独去除了每种成分，这导致类器官的数量和大小显著减少，并在培养10天后细胞活力也显著降低，这说明每种组分对于LGR5 CPCs的最佳类器官形成至关重要。

培养系统中单个CPC生成人工耳蜗类器官。DOI:https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2022.11.024

研究人员进一步研究了CPC扩增培养基中的其他成分对培养的LGR5祖细胞转录组特征的影响，结果发现，该成分组合将LGR5祖细胞重新编程到相对较早的阶段。

之后研究人员评估了新型扩增培养基对生理上更相关的内耳组织的影响，结果发现证明先天性HC也可以被这些有效化合成分激活成增殖状态，并且这些类器官在早期传代期间保持基因稳定性。

扩增组分的再生效应和稳定扩增类器官的表征。DOI:https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2022.11.024

接下来研究人员分期建立3D共培养系统，生成具有功能的神经支配类器官。为了深入了解共培养物上皮区室发育过程中的细胞类型规格和转录谱，研究人员对扩增培养基中收集的类器官进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），早期分化（共培养后5天）和晚期分化（共培养后25天），随着分化的进展，观察细胞比例的动态变化。实时荧光定量 PCR 显示，在类器官发育过程中，LGR5 表达逐渐降低，HC 标记基因表达增加。

由于转录因子（TF）是决定细胞命运的重要调节因子，因此研究人员鉴定了在发育中的类器官中表达丰富的细胞类型特异性TF。结果发现，发育中的类器官HC的遗传特征与早期发育过程中的耳蜗HC相似。此外，对分化不同阶段HC进行纤毛形态学观察、离子通道电生理研究、钙离子成像技术突触功能分析，进一步明确了该类器官更接近耳蜗类器官，同时毛细胞和螺旋神经元之间具备功能性突触连接。

类器官中的 HC 概括了出生后耳蜗 HC 的形态和电生理特征。DOI:https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2022.11.024

在本研究中，研究人员开发了一种优化的方案来生成神经支配的耳蜗类器官，该类器官具有耳蜗感觉上皮和功能性HC-SGN回路的主要细胞类型。首先，CPCs在最佳扩增介质中获得了增强的增殖能力。它们被重新编程为祖细胞的相对较早阶段，并且可以通过激活Wnt和YAP信号。其次，共培养系统实现了HCs分化与神经突生长之间的平衡，神经元促进耳蜗HCs的形成，并与HCs达到功能性突触。此外，通过scRNA-seq、电生理学和形态学分析，剖析了类器官HC的特征和HC发育的调控机制，认为神经支配类器官是研究内耳发育和感音神经性听力损失的可靠模型。