【模板】基因变异影响吸烟诱发COPD的发生，发在9+ SCI；课题设计策略非常巧妙

导言：

吸烟是COPD发病中排第一位的诱因，针对临床上这样常见的致病因素和疾病，怎样找到合适的研究切入点，以开启国自然申请的第一步呢？

美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学的临床研究者，于2022年3月17日在Thorax（IF=9.1）上发表了题为Cigarette smoking is a secondary cause of folliculin loss 的研究型论文，针对FLCN基因与COPD患者BHD综合征中肺部囊状改变这一切入点，进行疾病的发病机制的初步研究，实验方法简单，但逻辑设计精巧，对临床医生的课题开展非常有借鉴意义，分享给大家，可供课题设计时做参考。

关键逻辑：

*FLCN基因缺失是BHD综合征中肺部囊状改变的常见改变；

*FLCN基因缺失在吸烟者中可见，但FLCN基因缺失与吸烟之间的关联性尚无研究。

实验方法：

siRNA转染、WB、免疫沉淀法(IP)、qPCR。

研究结果：

*吸烟使COPD患者肺中的FLCN出现耗竭;
*吸烟通过泛素-蛋白酶体(ubiquitin-proteasome)机制在丝氨酸62(serine 62)处磷酸化使 FLCN的表达失去稳定性

（在永生化中的人支气管上皮 Beas-2B 细胞中，吸烟通过泛素蛋白酶体系统，引起FLCN的降解)。

进一步的研究计划：

探索吸烟引起的 FLCN 缺失在 COPD进展中的潜在因果作用。

主要研究设计

（表1. 准备用于评估肺FLCN的COPD患者与对照组的情况）

（表2. 引物设计表）

（图1.吸烟使COPD患者肺中的FLCN表达减少）

3，吸烟使小鼠肺中的FLCN表达减少。

4，FLCN 保护 BEAS-2B 细胞免受香烟烟雾诱导的细胞毒性损伤。

A)原代人肺泡上皮细胞 (pHAEC)  & 原代人支气管上皮细胞 (pHBEC) ，

对照用 有&没有2%CSE（香烟烟雾提取物）下培养 24 小时，

WB分析 FLCN和管家蛋白β-Actin；

B)Beas-2B细胞加入不同浓度的 CSE (0, 1, 2, 4, 6%)培养 8 小时，WB分析 FLCN和管家蛋白β-Actin；

C)Beas-2B细胞加入2%CSE培养 8 小时，WB分析 FLCN和管家蛋白β-Actin；

D)C)中WB结果的量化曲线；

E)提取细胞中的总 RNA,通过 qPCR 测量 FLCN mRNA 的水平，曲线表示FLCN与 管家基因GAPD相比的相对倍数差异；

F)使用siCTRL(乱序转染的对照组) & siFLCN 的BEAS-2B 细胞 72 小时后，WB分析细胞裂解物中的FLCN、管家蛋白β-Actin；

G)使用siCTRL(乱序转染的对照组) & siFLCN 的BEAS-2B 细胞 48 小时后，用有&没有2%CSE条件下培养 24 小时，进行MTT测定以分析细胞活力；

H)使用对照组空载体&FLCN-HA质粒转染BEAS-2B细胞48小时，WB分析细胞裂解物中的FLCN、管家蛋白β-Actin，WB数据为三次独立实验数据；

I)FLCN-HA质粒转染BEAS-2B细胞24小时，细胞固定，进行HA染色 & Alexa Fluor染色；

J)HA染色标记的FLCN &对照组空载体 转染BEAS-2B细胞24小时，并在 有&没有 2% CSE的情况下进一步培养24小时，进行MTT测定以分析细胞活力；数据为三次独立实验数据，一式三份样品。

（图3. FLCN 保护 BEAS-2B 细胞免受香烟烟雾诱导的细胞毒性损伤）

5，蛋白酶体降解FLCN。

A) leupeptin(蛋白酶 ) & MG132(蛋白酶体抑制剂 ) & 对照组空载体 处理CHX(蛋白合成抑制剂 ) 中的BEAS-2B 细胞，WB分析细胞裂解物中的FLCN、管家蛋白β-Actin；

B) A)中WB结果的量化曲线；

C) 使用HA 标记 FBXO23 、 FBXO41 质粒转染的 BEAS-2B 细胞，WB分析细胞裂解物中FLCN & HA & β-Actin抗体的免疫印迹，数据为三次独立实验数据；

（图4. 蛋白酶体降解FLCN）

6，FBXO23靶向FLCN 进行蛋白酶体降解。

A)将带有V5标记（用于检测重组蛋白）的F-box O家族质粒转染到BEAS-2B细胞中，WB分析细胞裂解物中FLCN & V5 & GAPDH抗体；

B)A)中WB结果的量化曲线；

C)使用V5标记 FBXO23 、FBXO41质粒转染BEAS-2B细胞，WB分析细胞裂解物中FLCN & V5 & β-Actin抗体，数据为三次独立实验数据；

D) C)中WB结果的量化曲线；

E)使用V5标记 FBXO23 、FBXO41质粒转染的BEAS-2B细胞，将V5标记的FBXO23或FBXO41质粒转染到BEAS-2B细胞中，对细胞裂解物进行鼠IgG & V5免疫沉淀，WB分析细胞裂解物免疫沉淀中的FLCN & V5 & GAPDH抗体，数据为三次独立实验数据；

（图5. FBXO23靶向FLCN 进行蛋白酶体降解）

7，丝氨酸62(serine 62)的磷酸化促进香烟烟雾诱导的FLCN降解。

A)BEAS-2B 细胞分别在 NU7441 (高选择性DNA-PK抑制剂) & VE-821(ATP竞争性ATR抑制剂) &  KU-55933 (ATM抑制剂) 环境中，用 2% CSE 处理 24小时，WB分析细胞裂解物中的 FLCN & 磷酸化 ATM (pATM) & 总ATM抗体；

B)用 ATM siRNA (siATM) & 乱序siRNA (siCtrl) 转染BEAS-2B细胞48小时后，在 有&没有 2% CSE的情况下进一步培养8 小时，WB分析细胞裂解物中ATM & FLCN & β-Actin抗体；

C)分别用 siATM & siCtrl(乱序siRNA ) 转染BEAS-2B细胞24小时，再以FBXO23质粒转染细胞，并培养48小时后，用2%的CSE处理 4 小时，WB分析细胞裂解物中的V5 & FLCN  & GAPDH(管家基因) & ATM抗体，WB数据为三次独立实验；

D)将 HA 标记的 FLCN (WT) & S62A突变 质粒分别转染到BEAS-2B细胞中24小时后，用2%的CSE处理细胞8小时，WB分析细胞裂解物中的 HA & β-Actin抗体；

E)D)中WB结果的量化曲线；

F)将 FLCN（WT）& FLCN S62A突变质粒分别转染到BEAS-2B细胞中，对细胞裂解物进行HA免疫沉淀，WB分析细胞裂解物免疫沉淀中的磷酸丝氨酸 & HA & GAPDH抗体，数据为三次独立实验数据；

G)将 FLCN（WT）& FLCN S62A突变质粒分别转染到BEAS-2B细胞中，用2%的CSE处理细胞过夜，进行MTT测定以分析细胞活力，数据为三次独立实验数据。