【模板】Parkin介导的COPD相关肌肉减少；简单的设计、严谨的论证，发表于12+ SCI

关键逻辑：

*Parkin基因表达水平降低常见于吸烟引起的COPD中的肌肉萎缩症患者；

*Parkin基因表达水平降低，通过降低线粒体自噬，升高线粒体活性氧（ROS），引起MuRF-1激活，加剧肌肉萎缩。

*此类肌肉萎缩可通过体育锻炼预防。

主要实验方法、器材：

siRNA转染、WB、显微电镜、电脉冲发生器。

研究结果：

*Parkin介导的线粒体自噬通过调节线粒体活性氧（ROS），在调节肌管萎缩中起关键作用；

*增加的线粒体活性氧（ROS）通过激活MuRF-1介导的MHC降解导致肌管萎缩。

*运动有可能预防 COPD 相关肌肉减少症的进展。

主要研究设计

A)成肌细胞和肌管图像；

B)WB分析实验组（2%CSE处理48小时的肌管细胞）与对照组肌管细胞中的抗MHC & 抗GAPDH(管家基因)，并将WB结果归一化做条形图（重复三次独立实验）；

C) MHC免疫荧光染色48小时成像：对照组（随机选择的肌管细胞的直径）&实验组（2%CSE处理48小时的肌管细胞的直径），并将结果量化做条形图；

D)TOMM20免疫标记(线粒体外膜受体抗体) 与 MitoTracker红色荧光标记(活细胞线粒体的染色)48小时成像：对照组（随机选择的肌管细胞的面积）&实验组（2%CSE处理48小时的肌管细胞的面积），并将结果量化做条形图；

E) 实验组（2%CSE处理）肌管细胞& 对照组肌管细胞中的线粒体活性氧（ROS）结果, 量化做条形图：DCFH-DA探针法检测ROS荧光；

F) 肌管细胞线粒体活性氧（MitoSOX Red预处理 6 小时，检测ROS荧光） & 肌管的相位对比：2%CSE处理的肌管细胞；并将肌管细胞的面积量化做条形图；

G)WB分析DMSO+Mito TEMPO（线粒体靶向SOD模拟物）处理后的肌管细胞中 抗MHC & 抗Parkin & 抗GAPDH(管家基因)，重复四次独立实验；

H)DMSO+Mito TEMPO实验组（2%CSE处理）肌管细胞& DMSO+Mito TEMPO对照组(PBS处理)肌管细胞：MHC免疫荧光染色图像；并将肌管细胞的直径结果量化做条形图；

（图1. 吸烟引起肌管萎缩，并观察到线粒体损伤、线粒体ROS升高）

3，吸烟导致的线粒体自噬引起线粒体活性氧（ROS）升高和肌管萎缩。

4，在吸烟引起的肌萎缩中，Parkin基因低表达引起线粒体自噬、降低线粒体完整性。

A) 分别以 2%CSE & 空白对照 处理  实验组（Parkin siRNA处理的肌管细胞） & 对照组（非识别对照siRNA处理的肌管细胞）后，

WB分析抗TOMM20(线粒体外膜受体抗体) & 抗GAPDH(管家基因)；

将WB结果的归一化做条形图（重复四次独立实验）；

B) 分别以 2%CSE & 空白对照 处理  实验组（Parkin HA标签载体转染的肌管细胞） & 对照组（空白质粒转染的肌管细胞）后，WB分析抗TOMM20(线粒体外膜受体抗体) & 抗GAPDH(管家基因)；

将WB结果的归一化做条形图（重复四次独立实验）；

C) 分别以 2%CSE & 空白对照 处理 实验组（Parkin siRNA处理的肌管细胞） & 对照组（非识别对照siRNA处理的肌管细胞）后，WB分析抗p62 & 抗PINK1 & 抗GAPDH(管家基因)；

将WB结果用抗p62 & 抗PINK1对照 抗GAPDH(管家基因)的相对增加的平均值 量化做条形图（分别重复五次+四次独立实验）；

D)分别以 2%CSE & 空白对照 处理 实验组（Parkin siRNA处理的肌管细胞） & 对照组（非识别对照siRNA处理的肌管细胞）后，

WB分析线粒体蛋白质中的抗p62 & 抗泛素&抗TOMM20(线粒体外膜受体抗体；

将WB结果的抗TOMM20& 抗p62的平均值 量化做条形图（分别重复三次+四次独立实验）；

E) 分别以 2%CSE & 空白对照 处理 抗p62 & pEGFP-LC3B标签 & 非识别对照siRNA & Parkin siRNA & HA标签转染的肌管细胞：线粒体共聚焦激光扫描显像的共定位分析；

F)以 2%CSE分别处理 2 Baf A1（抑制自噬） & 空白对照 的肌管细胞；

非识别对照siRNA & Parkin siRNA & Parkin HA标签转染的肌管细胞：自噬体共聚焦激光扫描显像；

（图3. 在吸烟引起的肌萎缩中，Parkin基因低表达引起线粒体自噬、降低线粒体完整性）

5，在Parkin基因表达水平降低引起的线粒体自噬降低的条件下，MuRF-1是出现肌萎缩的原因。

A)以 2%CSE分别处理非识别对照siRNA & Parkin siRNA 转染的肌管细胞，

WB分析抗MuRF-1 & 抗GAPDH(管家基因)；

将WB结果的归一化做条形图（重复三次独立实验）；

B) 以 2%CSE分别处理非识别对照siRNA & Parkin HA标签 转染的肌管细胞，

WB分析抗MuRF-1 & 抗GAPDH(管家基因)；

将WB结果的归一化做条形图（重复三次独立实验）；

E) 以2%CSE分别处理非识别对照siRNA &MuRF-1 siRNA 转染的肌管细胞：MHC 的免疫荧光染色图像；

将肌管细胞的直径结果量化做条形图；

F) 以MitoSOX Red（线粒体活性氧，检测ROS荧光）分别处理 有&没有2%CSE 组的肌管细胞：荧光显微镜检测线粒体成像；

将成像结果量化做条形图；

（图4. 在Parkin基因表达水平降低引起的线粒体自噬降低的条件下，MuRF-1是出现肌萎缩的原因）

6，吸烟对Parkin基因敲除小鼠的影响。

A) 野生型 (WT) 小鼠 & Parkin 敲除 (PKO) 小鼠 在吸烟环境中的体重变化过程曲线；

B)使小鼠用前肢抓住金属丝的中部，记录小鼠完全松开手倒下的时间（重复三次独立实验）；

C)分别测量  野生型 (WT) 小鼠 & Parkin 敲除 (PKO) 小鼠 的 腓肠肌(GC) & 胫骨前肌(TA) & 比目鱼肌(SOL) & 趾长伸肌(EDL)  的肌肉重量；

D) 选择  野生型 (WT) 小鼠 & Parkin 敲除 (PKO) 小鼠 的腓肠肌(GC) 肌肉切片成像；

根据肌纤维直径将成像结果量化做条形图；

E) 根据 野生型 (WT) 小鼠 & Parkin 敲除 (PKO) 小鼠 的腓肠肌(GC)横截面积 (CSA)量化做条形图；

（图5. 吸烟对Parkin基因敲除小鼠的影响）

7，吸烟诱导线粒体损伤/出现线粒体ROS、MuRF-1 表达增加，从而导致肌萎缩。

A)以 吸烟环境&空白对照 分别处理 野生型 (WT) 小鼠 & Parkin 敲除 (PKO) 小鼠6个月，提取的 腓肠肌(GC)后，

WB分析  抗MuRF-1 & 抗TOMM20 & 抗Parkin & 抗MHC & 抗p62 & 抗GAPDH；

将WB结果的量化做条形图（重复四次独立实验）；

B)以 4-HNE(脂质荧光染色)处理 野生型 (WT) 小鼠& Parkin 敲除 (PKO) 小鼠；

根据肌纤维计数归一化荧光显微镜成像；

C)以TOMM20(线粒体外膜受体抗体)染色 吸烟环境&空白对照 分别处理 野生型 (WT) 小鼠 & Parkin 敲除 (PKO) 小鼠6个月后提取的 腓肠肌(GC)，荧光显微镜成像；

根据肌纤维计数归一化荧光显微镜成像；

8，COPD伴肌肉萎缩症患者的臀大肌样本中，Parkin基因表达水平降低，升高线粒体活性氧（ROS），升高MuRF-1。

A)股四头肌样本中的Parkin基因表达水平：79名COPD患者 &　16名健康对照者

(GSE100281)；

B)分别取来自　无COPD无肌萎缩 & 有COPD有肌萎缩　患者的臀大肌样本，

WB分析　抗MuRF-1& 抗TOMM20 & 抗Parkin & 抗p62 & 抗-PINK1 & 抗GAPDH(管家基因)；

将WB结果的量化做条形图；

C)以 4-HNE(脂质荧光染色)处理　无COPD无肌萎缩 & 有COPD有肌萎缩　患者的臀大肌样本：共聚焦激光扫描显微镜成像；

根据肌纤维计数归一化荧光显微镜成像；

D)以TOMM20(线粒体外膜受体抗体)染色　处理　无COPD无肌萎缩 & 有COPD有肌萎缩　患者的臀大肌样本：共聚焦激光扫描显微镜图像；
根据肌纤维计数归一化荧光显微镜成像；

箭头表示线粒体的积累。

9，COPD伴肌肉萎缩症患者的臀大肌样本中，Parkin基因表达水平降低，升高线粒体活性氧（ROS），升高MuRF-1。

A) 电脉冲刺激肌管细胞，分为 收缩组&无收缩组；

WB分析抗MHC & 抗Parkin & 抗GAPDH(管家基因)；

将WB结果的量化做条形图（重复三次独立实验）；

B) 电脉冲刺激肌管细胞，分为 收缩组&无收缩组,

非识别对照siRNA &Parkin siRNA 转染的肌管细胞,

WB分析抗MHC & 抗Parkin & 抗GAPDH(管家基因)；

将WB结果的量化做条形图（重复三次独立实验）；

C)以 有&无2%CSE 分别处理电脉冲刺激的 肌管细胞后,

WB分析抗MHC & 抗Parkin & 抗GAPDH(管家基因)；

将WB结果的量化做条形图（重复四次独立实验）；