单基因泛癌也能发表纯生信？用这个思路搞定影响因子4.77分SCI

题目：“A comprehensive prognostic and immune infiltration analysis of EXOC3L1 in pan-cancer”（EXOC3L1在泛癌中的预后和免疫浸润综合分析）

期刊：Frontiers in Genetics

IF：4.772（2022年）

全文共12张图（正文10➕补充材料2），7张表（补充材料7）

套路：单基因泛癌

基因：EXOC3L1

数据来源： TCGA（数据库）、 UCSC Xena（数据库）

技术路线： 

表达差异（Figure 1| EXOC3L1 mRNA在泛癌中的表达；Figure 2|免疫组化分析）→临床意义（Table S1-S6| Cox回归分析；Figure 3-5|泛癌中EXOC3L1表达和总生存期OS、疾病特异性生存期DSS和无进展间隔期PFI的关系；Figure 6| EXOC3L1表达和临床特征的相关性；Figure 7| 列线图和校准曲线；Figure S1| ROC曲线）→交互网络（Figure 8| EXOC3L1表达和免疫细胞浸润的相关性；Figure 9| 基于不同免疫细胞亚群的亚组K-M曲线；Figure S2| PPI蛋白互作网络）→功能聚类（Figure 10| EXOC3L1相关基因的富集分析）

图表简介：

Figure 1 | EXOC3L1 mRNA在泛癌中的表达

Figure 2 | 泛癌中EXOC3L1在正常和肿瘤组织中的IHC（免疫组化）图像

Table S1| Cox回归分析-ACC

Table S2| Cox回归分析- KIRC

Table S3| Cox回归分析-LUSC

Table S4| Cox回归分析-KIRP

Table S5| Cox回归分析-THCA

Table S6| Cox回归分析-PAAD

Figure 3 | 泛癌中EXOC3L1表达和OS（总生存期）的关系

Figure 4 | 泛癌中EXOC3L1表达和DSS（疾病特异性生存期）的关系

Figure 5 | 泛癌中EXOC3L1表达和PFI （无进展间隔期）的关系

Figure 6| 泛癌中EXOC3L1表达和临床特征的相关性

Figure 7| KIRC 和 LUSC列线图和校准曲线

Figure S1| KIRC，LUSC和PAAD的ROC曲线

Figure 8| EXOC3L1表达和免疫细胞浸润的相关性

Figure 9| 基于不同免疫细胞亚群的亚组K-M曲线

Figure S2| 100个EXOC3L1相关基因PPI蛋白互作网络

Figure 10| EXOC3L1相关基因的富集分析

Table S7| 通过GEPIA2得到的100个EXOC3L1相关基因

分析工具：

仙桃学术（https://www.xiantao.love/）（新版）  

各种生信分析工具

HPA数据库 (https://www.proteinatlas.org) 

免疫组化分析

GEPIA2数据库（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）

和EXOC3L1相关性最高的100个基因的提取

TIMER2.0数据库（http://timer.comp-genomics.org/）

免疫浸润相关性分析

STRING数据库（https://string-db.org/）  

PPI蛋白互作网络分析

首先复现Figure 1，一共有3张小图。Figure 1A，Figure 1和Figure 1C。

Figure 1A和Figure 1B是 EXOC3L1mRNA在泛癌中的表达差异可视化图-非配对样本（Figure 1A：TCGA-GTEx数据库，Figure 1B：TCGA数据库）。

Figure 1C是 EXOC3L1 mRNA在泛癌中的表达差异可视化图-配对样本。我们可以用仙桃学术生信工具完成。

我们先来看一下如何进入仙桃学术生信工具。

进入仙桃学术（https://www.xiantao.love/）（新版）→选择“生信工具”→选择【高级版】 的【立即使用】（注：免费版和基础版都可以进行统计和可视化，由于高级版功能最全，这里选择高级版作为范例） ，就可以进入生信分析界面。

Figure 1A和Figure 1B是同类型图片，只是数据来源不同，我们以Figure 1A：TCGA-GTEx数据为例复现。

复现过程：鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【系列模块】→右侧导航栏选择【泛癌系列】中的【[泛癌]分组比较】→【云端数据】选择【TCGA＿GTEx-ALL数据集】 →分子输入【EXOC3L1】→默认其他参数→点击【确认】→下载图片、保存结果或下载整份报告。同理，得到Figure 1B只需要选择云端” TCGA-ALL数据集“即可。

PS：历史记录只保存30天的记录，超过30天的记录会自动清理。所以建议大家一定要及时下载结果，避免数据丢失。

Figure 1C 是 EXOC3L1 mRNA在泛癌中的表达差异可视化图-配对样本。

Figure 1C复现过程：鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【系列模块】→右侧导航栏选择【泛癌系列】中的【[泛癌]配对图】→【云端数据】选择【TCGA -ALL数据集】 →分子输入【EXOC3L1】→默认其他参数→点击【确认】→下载图片、保存结果或下载整份报告。

Figure 2 是泛癌中EXOC3L1在正常和肿瘤组织中的IHC（免疫组化）图像。

以PAAD正常组织的IHC为例，我们在HPA数据库中寻找相应的免疫组化图像。

进入HPA数据库(https://www.proteinatlas.org) →输入分子名称EXOC3L1→点击【Search】→选择“EXOC3L1”分子对应的【Tissue】→跳转界面→选择【Pancreas

】→跳转界面→下拉页面就可以看到正常胰腺组织的IHC图像→点击一个IHC图像→跳转界面→左侧显示样本信息，右侧是对应的IHC图像，截图保存或者鼠标右键点击图像，下载所有的IHC图像后再选择需要的图像。

下载的文件如下图所示：

接下来查找PAAD病理组织的IHC图像。

在上面的第3步中，选择【Pathology】→在【CANCER】下拉列表中选择【pancreatic cancer】→跳转界面→下拉页面找到【PANCREATIC CANCER - Protein expression】，左上方显示【Staining】，【Intensity】，【Quantity】，【Location】4个选项，选择后相应的IHC图像显示绿色边框（如果不选择上方选项，也可以点击单个图片，查看图片和来源样品信息）→点击相应图像→跳转界面→左侧显示来源样品信息，右侧是对应的IHC图像，可以通过”➕“和”“➖”来调整显示比例大小，鼠标左键拖动图像→截图保存或者鼠标右键点击图像，下载所有的IHC图像后再选择需要的图像。

下载的文件如下图所示：

Table S-S6| Cox回归分析

我们以ACC为例，来复现Cox回归分析。

过程如下：进入仙桃学术生信工具→鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【临床意义】→右侧导航栏选择【预后类】中的【[云]Cox回归】→【云端数据】选择【TCGA-ACC数据集】→【分子】输入EXOC3L1→【变量】添加【Age，Gender， Tumor status， Pathological stage， Laterality 和（分子-中位数分组）EXOC3L1】→添加分组→【预后类型】选择【OS】→默认其他参数→点击【确认】→下载Cox回归结果.xlsx和.docx文件。

Cox回归结果.xlsx：

Cox回归结果.docx：

Figure 3是泛癌中EXOC3L1表达和OS（总生存期）的关系，分为2张小图，Figure 3A是森林图，显示了泛癌中EXOC3L1表达对OS的影响。

Figure 3B又分为4张小图，分别展示了ACC，KIRC，LUSC和PAAD四种癌症的K-M生存曲线。

我们在仙桃中复现Figure 3A。因为涉及33个癌种，需要较多的步骤才能完成，耗时较长，我们先以ACC和BLCA这2个癌种为例来复现，需要3步：

第1步：Cox回归分析-ACC

第2步：Cox回归分析-BLCA

第3步：Cox回归分析结果整合

第4步：森林图绘制

首先完成第1步：Cox回归分析-ACC。进入仙桃学术生信工具→鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【临床意义】→右侧导航栏选择【预后类】中的【[云]Cox回归】→【云端数据】选择【TCGA-ACC数据集】→【分子】输入EXOC3L1→【变量】输入【EXOC3L1】，添加的是【EXOC3L1中位数分组】→【分组】添加【Low[中位数]】和【High[中位数]】→【预后类型】选择【OS】→默认其他参数→点击【确认】→保存结果→下载Cox回归结果.xlsx和.docx文件。

Cox回归结果.xlsx如下：

Cox回归结果.docx如下：

第2步：同第1步，只需要在【云端数据】选择【TCGA-BLCA数据集】，就可以得到Cox回归分析-BLCA。

第3步：将前2步得到的Cox回归分析中单因素分析部分整合到一个EXCEL文件中，并将第1列中【Characteristics】名称的EXOC3L1修改为ACC和BLCA，

第4步： 

鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【临床意义】→右侧导航栏选择【临床相关】中的【森林图】→上传数据→点击【验证】→点击【确认】→【保存结果】、【下载整份报告】或不同格式的森林图图片。

我们看到森林图中字迹重叠，需要调整【主要参数】中【图片】的【宽度】并点击【确认】→下载图片。

调整好的森林图文字清晰，没有重叠现象。

大家按照上述方法，整理33个癌种的Cox回归结果就可以得到Figure3A。形式上和原文略有不同，但是主要内容是一致的。

Figure 3B| ACC，KIRC，LUSC和PAAD四种癌症的K-M生存曲线。

我们以ACC为例在仙桃中复现：

进入仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products/apply/c0b6febb-52dd-4525-970a-61bbe9e263ff）→鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【临床意义】→右侧导航栏选择【预后类】中的【[云]生存曲线（KM）图】→【云端数据】选择【TCGA-ACC数据集】→【预后类型】选择【OS】→默认其他参数→点击【确认】→下载图片。

PS：

我们在仙桃中已经完成部分分析之后，有的模块会自动记忆【特殊参数】中输入的【分子】，我们在上述步骤中没有输入分子这一步，就是因为模块的记忆功能，但是大家在绘图是一定要检查一下，如上图【5】中所示，确保分子名称的正确。

下载区除了提供pdf、tiff 和pptx格式的图片外，还提供了 xlsx格式的分析数据和数据分组情况，以及核心源码，大家可以下载查看。 

Figure 4 | 泛癌中EXOC3L1表达和DSS（疾病特异性生存期）的关系

Figure 5 | 泛癌中EXOC3L1表达和PFI （无进展间隔期）的关系。

这两张图和Figure 3形式相同。

大家只需要参考Figure 3A复现过程，第1步和第2步中【预后类型】选择【DSS】和【PFI】，就可以得到Figure 4A和Figure 5A。

参考Figure 3B复现过程，【预后类型】选择【DSS】和【PFI】就可以分别得到Figure 4B和Figure 5B，大家可以自己尝试完成。

Figure 6| 泛癌中EXOC3L1表达和临床特征的相关性，一共12张小图。

我们以KIRC中，EXOC3L1表达和性别的关系为例，在仙桃中复现。

Figure 6复现过程：

进入仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products/apply/c0b6febb-52dd-4525-970a-61bbe9e263ff）→鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【临床意义】→右侧导航栏选择【临床相关】中的【[云]临床意义（分组）】→【云端数据】选择【TCGA-KIRC数据集】→【临床变量】选择【（临床）Gender】→添加分组→主要参数中【箱】选择【不展示】→【小提琴】选择【展示】→【误差线】选择【均值±标准差】→默认其他参数→点击【确认】→下载图片。

PS：我们在仙桃中已经完成部分分析之后，有的模块会自动记忆【特殊参数】中输入的【分子】，我们在上述步骤中没有输入分子这一步，就是因为模块的记忆功能，但是大家在绘图是一定要检查一下，如上图【5】中所示，确保分子名称的正确。

PS：我们选取【误差线】用【均值±标准差】是为了和原文一致，选项中也有【均值±标准误】，一般来说标准差更能反应离散程度，根据需要也选取【均值±标准误】这个选项，便于读者判断数据的不确定性。

Figure 7| KIRC 和 LUSC列线图和校准曲线，Figure 7A, C| KIRC 和 LUSC列线图，Figure 7B, D| KIRC 和 LUSC校准曲线。

我们先通过仙桃来复现一张KIRC的列线图

复现过程：进入仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products/apply/c0b6febb-52dd-4525-970a-61bbe9e263ff）→鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【临床意义】→右侧导航栏选择【预后类】中的【[云]预后列线图】→【云端数据】选择【TCGA-KIRC数据集】→【变量】添加【（临床）Age】【（临床）Pathological stage】和【（分子-中位数分组）EXOC3L1】→添加分组→主要参数中【预后参数】选择【OS】→【预测时间】添加【1、3、5年】→默认其他参数→点击【确认】→下载图片。

Figure 7B | KIRC校准曲线。

复现过程：进入仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products/apply/c0b6febb-52dd-4525-970a-61bbe9e263ff）→鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【临床意义】→右侧导航栏选择【预后类】中的【[云]预后校准曲线】→【云端数据】选择【TCGA-KIRC数据集】→主要参数中【预后参数】选择【OS】→【预测时间】添加【1、3、5年】→【每次重复抽样的样本量】设置为80→点击【确认】→显示“成功提示→在上方菜单栏中找到刚才保存的结果，点击【下载】，在弹出的列表中选择即可下载图片。

PS：之前在仙桃完成列线图时，添加了【特殊参数】中的【变量】和【分组】，接着又开始校准曲线的绘制，仙桃自动记忆了之前添加的【变量】和【分组】，所以我们没有重复添加。大家在进行分析前需要仔细检查显示的【变量】和【分组】是否正确。

Figure S1| KIRC，LUSC和PAAD的ROC曲线。Figure S1一共有6张小图。

以KIRC为例Figure S1复现过程：

进入仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products/apply/c0b6febb-52dd-4525-970a-61bbe9e263ff）→鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【临床意义】→右侧导航栏选择【诊断类】中的【[云]诊断ROC】→【云端数据】选择【TCGA-KIRC数据集】→输入分子EXOC3L1→默认【主要参数】设置→点击【确认】→保存图片。

Figure 8| EXOC3L1表达和免疫细胞浸润的相关性

原文通过TIMER2.0数据库进行免疫浸润分析，完成了EXOC3L1表达和免疫细胞的相关性热图。我们也同样通过TIMER数据库来复现。

这里有一个有趣的现象，我们在TIMER2.0数据库中输入“EXOC3L1”发现没有相应的基因，在Gene Cards（https://www.genecards.org/）中查询后发现， EXOC3L1基因以前的HGNC符号是“EXOC3L”，所以我们在TINER2.0中输入“EXOC3L”就可以。

下面我们再来完整地给大家复现一下：

进入TIMER2.0数据库（http://timer.comp-genomics.org/）→在最左侧的【Immune Association】栏下选择【Gene】→输入分子EXOC3L1→选择免疫细胞，我们在这里选择了B cell→点击【submit】→跳转界面→点击左上角图标→打开下载文件→弹出热图图像→鼠标右键点击图像→另存为。同理，选择macrophages, T cell CD4+, and T cell CD8+ 等不同的免疫细胞，就可以得到其他的3张热图。大家可以自己尝试一下。

Figure 9| 基于不同免疫细胞亚群的亚组K-M曲线

“基于不同免疫细胞亚群的亚组K-M曲线”在生信分析中并不常见，建议大家用不同临床变量的亚组分析替代，我们在这里复现亚组K-M曲线。

我们还是在仙桃中完成绘图，以CESC的Age为例：

绘图过程：进入仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products/apply/c0b6febb-52dd-4525-970a-61bbe9e263ff）→鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【临床意义】→右侧导航栏选择【预后类】中的【[云]亚组KM图】→【云端数据】选择【TCGA-CESC数据集】→【特殊参数】下的【分子】输入【EXOC3L1】→【临床变量】选择【（临床）Age】【预后参数】设置为80→点击【确认】→显示“成功提示→在上方菜单栏中找到刚才保存的结果，点击【下载】，在弹出的列表中选择即可下载图片。

接下来的分析和复现都依赖于和EXOC3L1相关的100个top基因，我们称之为共表达基因，我们来看一下如何通过GEPIA 2获得这些共表达基因。

进入GEPIA 2数据库（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）→在【Single Gene Analysis】工具条下的输入框中输入EXOC3L1→点击【Similar】→跳转界面→选择【Top100】→在【TCGA Tumor】中全选并点击【Add】→点击【List】→跳转界面→点击【Download】下载列表。

下载的共表达基因列表如下所示：

Figure S2| 100个EXOC3L1相关基因PPI蛋白互作网络

原文的PPI互作网络图是直接在STRING数据库完成的，我们也在STRING数据库完成复现。

进入STRING数据库（https://string-db.org/）→左侧栏选择【Multiple proteins】→右侧输入top100共表达分子→物种选择【homo sapiens】→点击【search】跳转界面→点击【continue】→跳转界面→点击【Exports】，选择SVG格式文件保存图像。

Figure 10| EXOC3L1相关基因的富集分析

Figure 10共包含9张小图，Figure 10A| EXOC3L1相关基因在TCGA 33个癌种中表达的热图；

Figure 10B| 100个EXOC3L1相关基因的GO富集分析；

Figure 10C| 100个EXOC3L1相关基因的KEGG富集分析；

Figure 10D-I| 100个EXOC3L1相关基因的GSEA富集分析。

Figure 10A| EXOC3L1相关基因在TCGA 33个癌种中表达的热图。

我们分析了一下这张图，我们需要先在1个癌种的表达谱中，提取top100共表达基因的表达谱数据，然后对每一个基因的所有样本取均值或者最大值等，得到1列数据，同理对其余32个癌种的表达谱数据进行如上处理。之后再把33个癌种的top100共表达基因表达谱整合到1个EXCEL文件中，完成相关热图[原始矩阵]。

这个图的完成需要大量的数据处理工作，但其实并没有太大意义，只是凑图或者展示的作用，所以我们在这里不去复现，建议大家没有必要花大量的精力做这样的热图展示。

Figure 10B| 100个EXOC3L1相关基因的GO富集分析。

我们在仙桃中完成GO富集分析-气泡图。

第1步：GO富集分析

第2步：GO-气泡图绘制

第1步：GO富集分析过程：进入仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products/apply/c0b6febb-52dd-4525-970a-61bbe9e263ff）→鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【功能聚类】→右侧导航栏选择【GOKEGG】中的【[GOKEGG]分析】→上传获得的 top100共表达基因→【主要参数】下的【分子列表】输入【top100共表达基因】→【富集参数】下的【条目】选择【全部GO】→点击【确认】→保存结果。

PS：GOKEGG富集数据上传之后，分子列表会自动出现在分子列表栏，大家也可以不用单独输入分子列表。

第2步：GO气泡图绘制。进入仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products/apply/c0b6febb-52dd-4525-970a-61bbe9e263ff）→鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【功能聚类】→右侧导航栏选择【GOKEGG】中的【[GOKEGG]气泡图】→选择第1步保存的数据→默认其他参数→点击【确认】→保存结果。

Figure 10C| 100个EXOC3L1相关基因的KEGG富集分析。复现过程参考Figure 10B。在第1步中，选择【富集参数】的【条目】为【KEGG】（详见7），其余步骤同Figure 10B复现过程。

Figure 10D-I| 100个EXOC3L1相关基因的GSEA富集分析

我们以Figure 10D为例：

第1步：单基因差异分析

第2步：数据整理

第3步：GSEA富集分析

第4步：GSEA富集经典可视化

第1步：单基因差异分析过程：鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【表达差异】→右侧导航栏选择【差异分析】中的【[云]单基因-差异分析】→【分子】输入EXOC3L1→【分组】中的【参考组】默认选择【Low】→点击【确认】。

在【历史记录】中查看结果→当【状态】从【执行】变成【完成】后，可以下载结果。

下载的单基因差异分析数据如下所示：

第2步：按照仙桃[GSEA]富集分析上传数据格式要求整理数据，整理好的数据如下所示：

有了整理好的数据，我们就可以进行第3步：GSEA富集分析了。过程如下：

鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【功能聚类】→右侧导航栏选择【GSEA分析】中的【[GSEA]富集分析】→上传第2步整理好的数据→点击【验证】→点击【确认】→提示“任务提交成功”，点击【确定】→在【历史记录】中下载GSEA分析结果。

下载的GSEA分析结果如下所示：

【GSEA富集分析】用时较【单基因差异分析】短，稍作等待就可以在工具选择栏的【历史记录】中看到【状态】显示【完成】就可以进行下一步分析了。

第4步：GSEA经典可视化。复现过程如下：

鼠标滑动到上方工具选择栏【分析工具】→左侧导航栏选择【功能聚类】→右侧导航栏选择【GSEA分析】中的【[GSEA]经典可视化】→选择第2步【历史记录】中的【GSEA分析】数据→→添加【ID列表】中的【可视化ID】→点击【确认】→下载图片。

PS：【ID列表】是输入想要可视化的基因集 ID，默认为对应云端数据结果中每个类目的前 2 个条目，可以根据需要进行输入修改。

注意：输入的 ID 来自所选云端数据记录的结果，需要先在【历史记录】中找到对应的记录，下载 excel结果，复制想要展示的 ID 到这个输入框中，一行代表一个。最多支持 1 张图绘制同时绘制 5 个基因集，我们在复现中输入了2个ID，原文显示了3个ID。

好啦，今天的这篇文章就复现到这儿，除了复现正文部分，我们还结合了补充材料，是不是很贴心呢？ 

具体一些本文未涉及的分析内容大家可以参照往期的复现推文，也可以加入我们的生信训练营，包括但不限于基础班训练营、文章复现训练营、分模块教学的快闪营、写作工具训练营等等，从生信小白到生信高手的成长之路，感兴趣的小伙伴千万不要错过啦~