清华AM: 用离子凝胶电极在近生理环境下研究蛋白质隧穿结

2023-05-08 03:05

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生物分子内的电荷传导一直是理解生物体内电子传输路径的关键一步，但目前关于蛋白分子的电荷传导机理有两种机理解释：不受温度影响的相干隧穿和受温度影响的非相干隧穿（在大多数情况下，也被称为跃迁），前者通常在固相分子器件中观测到，而后者通常通过电化学的手段研究。因此，在蛋白质分子结的实验中观测到了两种电荷传导机理：隧穿和跳跃，但其中的原因仍不清楚。

针对这一科学问题，清华大学化学系李远副教授课题组在Advanced Materials上以研究论文的形式发表了题为“Ionogel-Electrode for the Study of Protein Tunnel Junctions under Physiologically Relevant Conditions”的研究成果。该工作设计合成了一种导电离子凝胶作为测量生物分子结的电极，该电极可以测试固液相的蛋白质分子自组装薄膜，发现在固相和液相中蛋白质分子结的电流密度不同。通过变温电导实验，发现蛋白质分子在固相遵循直接隧穿模型，但是在液相的传导机理切换成跃迁模型；随后又进一步对蛋白质分子活化能、辅基核心血红素、电荷跃迁开启电压等多个影响因素进行了深入探讨。

利用分子结研究生物分子的隧穿机理可分为单分子结和大面积分子结两种方法。前者一般利用扫描隧道显微镜（STM）或导电探针原子力显微镜（cp-AFM），绝大多数情况下需要对蛋白进行化学修饰来使其锚定在电极上，但对蛋白进行化学改造后，可能会改变其二级结构从而对电子传输路径产生影响，即使是无需修饰的蛋白，STM所能提供的测试电压范围也相对有限，背景噪音较大；后者可以利用物理吸附法，使蛋白的结构保持不变，但由于电极的限制只能在固相测试，测试结果相应多为隧穿而少见跃迁。电子如何在蛋白中传输、其传输机理又由什么因素控制，这些问题亟待解决。

在本篇研究工作中，研究人员基于离子凝胶设计合成了一种可以在液相和固相两种环境中测试的顶电极，将其应用于测试蛋白质分子结。相较于前人工作，该项工作极大程度上解释了关于蛋白质电荷传输机理的争议问题。首次通过实验揭示了在电子转移过程中环境偶极矩的重组能量需求，以及在连接两个电极之间的水合蛋白质分子内电荷跃迁通过一个血红素辅基所需的重组能量约为100 meV。另外，该测试技术也不需要特殊的测试装置，或者复杂的光刻技术，有利于被更大范围地应用于生物分子电学信号测试体系。

图1. 离子凝胶复合电极制备和蛋白分子结构筑测试示意图

研究人员将高分子单体加入离子液体中，再通过可控光引发聚合制备了高导电离子凝胶电极材料。通过将导电炭黑掺入离子凝胶中进一步将复合电极材料的电导提升到了XXX。蛋白分子的结构筑是利用带有羧酸或者磺酸官能团的自组装单层分子膜分别吸附人血清白蛋白（HSA）、细胞色素C（Cyt C）、血红蛋白（HGB）三种蛋白，再将离子凝胶复合电极贴附在蛋白质分子层的表面，从而实现离子凝胶复合电极/蛋白质分子层-单层分子膜/金电极的纵向隧穿结。这三种蛋白选择是基于其中的血红素（heme）辅基的所含数量不同，利用该顶电极对蛋白分子结进行测试，以期发现血红素辅基对电荷传导以及传导活化能的关系。

图2. 离子凝胶复合电极用于固态分子结的测试。

在进行蛋白质分子测试前，研究人员先将离子凝胶复合电极集成在PDMS薄膜上（图2. A-B），并对顶电极材料进行了扫描电镜的表征，证明其为纳米尺度平整的平面（图2. C）。随后他们用烷基硫醇标准样品分子结对新电极进行标定，在集成器件中测试的结果几乎完全重合（图2. D），并得出通过此电极测试的烷基链的电流密度和隧穿衰减因子都与其他测试方法的结果一致（图2. E-F），因此用离子凝胶电极进行分子结测试具有高度的重现性和可信度。

图3. 离子凝胶复合电极用于分子结在水中的测试。

为了将凝胶电极应用于蛋白分子结的水相测试，研究人员先将其在水相测试烷基硫醇和烷基羧酸两种自组装分子膜，自组装分子膜在水相和固相的电流密度和衰减系数均相差较小（图3. A-F），这表明分子结在水相没有法拉第漏电流。

图4. 蛋白质分子结的固液相电流密度对比。

研究人员通过测试三种蛋白质分子结在固相和液相的电流密度-电压曲线，发现蛋白分子结在固相的电流比在液相的普遍都大（图4. A-F），进而推测可能由于水的存在，使离子凝胶电极和蛋白之间的耦合作用减弱，隧穿机理发生了变化。为了验证猜想，他们进行了变温实验，得出结果如下图：

图5. 蛋白分子结的变温实验结果

在图中可以得出，蛋白分子结在液相的电流密度随温度升高而增大（图5. A-F），在固相中电流密度保持不变（图5. G-L）。根据阿伦尼乌斯公式进行拟合，液相电流密度的对数与温度的倒数成反比。这可证明蛋白在液相是跃迁机理但在固相是隧穿机理，从而解释了前人工作中蛋白电荷传输机理不明晰的原因，为未来蛋白分子结的测试提供了一个简单可靠易操作的技术平台。

图6. 蛋白液相跃迁活化能的影响因素

基于以上所得结论，研究人员对活化能的影响因素又做了更深入的分析。活化能与血红素基团的数量有线性关系（图6. A）。计算不同偏压下的活化能（图6. B），发现带有血红素辅基的细胞色素C和血红蛋白均存在开启电压。在开启电压以下，蛋白活化能围绕一个固定的值波动，在开启电压以上，蛋白活化能随偏压的增大线性增加，且斜率相近。但对于不含血红素的人血清白蛋白，活化能不存在开启电压的拐点。由此，推断得出带有血红素的蛋白隧穿机理（图6. C-D），在开启电压以下，活化能主要来自电子跃迁至肽链以及环境中水分子的重组，在开启电压以上，血红素基团也参与到电子跃迁过程中，因此活化能与血红素基团数量成正相关。

清华大学化学系李远副教授是本文通讯作者。清华大学化学系2021级博士生白希悦和科研助理李鹏飞为本文共同第一作者（现就读于天津大学-新加坡国立大学福州联合学院）。论文作者还包括清华大学化学系2022级博士生彭武贤、2020级博士生陈宁玥和2021级博士生林锦亮。该研究成果得到了国家自然科学基金（22273045）和清华大学自主科研计划前沿交叉专项青年教师创新课题的资助。