戊型肝炎病毒(HEV)与世界范围内的公共卫生有关，它影响着多种动物。禽HEV相关性大肝脾病(BLS)和肝炎脾大综合征(HSS)分别于1988年和1991年被报道。作者以中国地区分离到的aHEV3型细胞培养适应株YTaHEV(YT株)为研究对象，进行基础研究和应用研究。在静脉接种组和生理盐水组的鸡血清、粪便、胆汁和肝组织样本中均检测到aHEV RNA和aHEV免疫球蛋白。在整个实验过程中，所有对照鸡都保持阴性。在14只接种的鸡中，有13只检出粪便病毒脱落和病毒阳性的肝脏样本,14只鸡中有12只血浆样本aHEV RNA呈阳性,这表明这些分析可以作为HEV感染的免疫学指标,用ELISA检测了血清样本中的抗aHEV抗体，结果表明，感染组和生理盐水对照组的所有样本均为阴性。图A中的体重数据表明，病毒感染对鸡胚胎发育没有显著影响。作者计算了所有个体的肝脏指数，以评估感染HEV的肝脏是否增大。计算了所有鸡的肝脏指数(肝脏重量/体重×100%)，如图B所示。免疫组鸡的肝脏指数高于对照组，说明SPF鸡感染病毒后肝脏增大。根据大体病理和肝组织病理学检查结果，作者对肝损伤指标ALT和AST进行了检测。与对照组相比，ALT活性没有显著变化(图B)，而AST水平升高(图C)。肝脏病变如图D所示。与对照组相比，接种组鸡的肝脏明显增厚和肿胀。感染的肝脏变得油腻，边缘钝而圆，肝表面有明显的出血点，与临床病例相似(图E-H)。组织病理学观察支持上述现象，并表明YT菌株引起肝脏损伤，如充血、肝脏脂肪变性和凋亡小体(图I-M)。对照组未见肝脏病变。
研究表明，病毒性肝炎造成的肝损伤是由宿主对受感染的肝细胞表达的病毒蛋白的免疫反应引起的，而不是由病毒的直接细胞病变效应引起的。用YT株感染LMH细胞，研究YT株感染LMH细胞诱导的先天免疫反应。然后用实时定量聚合酶链式反应检测感染细胞中与先天免疫相关的几种抗病毒蛋白或细胞因子的mRNA表达水平。与未感染的LMH细胞相比，感染YT菌株的LMH细胞中2‘-5’-寡腺苷合成酶样蛋白(OASL)的水平从24 h增加到96 h。值得注意的是，抗病毒信号蛋白线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)在感染YT株后降低了细胞中的mRNA水平。其他抗病毒蛋白和细胞因子，如黑色素瘤分化相关蛋白5(MDA5)、含TIR结构域的适配器诱导干扰素-b(TRIF)、抗病毒干扰素-(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ、FN-kB和TNF-α，在感染细胞和未感染细胞中均无显著差异(图A)。为了在体内验证这一结论，作者分析了YT株感染鸡肝脏中FN-kB和TNF-α的表达水平。如图B所示，与正常肝脏相比，感染YT株上调了OASL的表达水平，增加了300倍，而MAVS的水平下调了。这些数据表明，YT株在体外和体内都能诱导高水平的OASL并抑制MAVS的表达。在感染YT菌株后，体内研究中的MX水平显著高于体外研究中的水平。病毒感染、复制和宿主的先天免疫之间总是有着密切的关系。因此，作者描绘了感染后不同时间细胞内和细胞外病毒的生长曲线。随着时间的推移，细胞内病毒水平逐渐增加，在4dpi时达到峰值，表明抗病毒蛋白和相关细胞因子都下调了。在感染后第5天和第6天，细胞内病毒含量开始下降，而细胞外病毒含量显著增加，表明大多数病毒在细胞外释放(图C)。TLR介导的先天性免疫细胞对病原体的识别在诱导清除感染所需的促炎免疫反应中发挥着重要作用。作者从MYD88信号水平分析了各禽类TLR在体外和体内的表达水平。用300 TCID50的YT株感染LMH细胞，在1、2、4和6h时检测细胞内TLR的表达。结果如图A所示。随着时间的推移，TLRs的水平逐渐增加。在6h时，所有6种TLR的mRNA水平均显著高于对照组。体内实验结果支持这些体外实验结果。肝脏TLR3、4、5、7、15和21mRNA的表达水平与YT株感染有关。在aHEV阳性个体中，TLR3水平的升高最为显著(高达100倍)。综合来看，这些结果提示TLR3参与了炎症过程的启动。作者用高、低剂量病毒感染LMH细胞，分别于1、2、4、6h收集细胞和培养上清。结果表明，IL-1b和IL-18mRNA的表达水平呈剂量和时间依赖性上调(图A，B)。因此，炎症和病毒感染之间存在剂量依赖关系。ELISA法结果显示细胞培养上清液中IL-1b的表达水平升高，但IL-18水平与未感染细胞相比无显著差异(4C)。从1日龄雏鸡采集的肝脏和淋巴细胞样本用于检测这两种关键细胞因子的水平(图D-F)。IL-1b和IL-18mRNA在肝脏和淋巴细胞中的表达水平均升高。这些结果证实了YT株在体内外诱导的炎症反应。六、NF-kB和MAPK信号通路参与YT株诱导的炎症信号通路的调节作者比较了抑制剂处理和未处理细胞中IL-1b和IL-18的水平。信号通路包括p38MAPK、JNK、p44/42MAPK(ERK1/2)和NF-kB。在实验中，使用了不同浓度的抑制剂，它们是根据推荐的浓度范围和它们对应答者LMH细胞存活和增殖的实际毒性效应来选择的(图A-D)。用抑制剂处理细胞2小时，然后病毒感染。用6h时IL-1b、IL-18等细胞因子的mRNA表达水平评价炎症反应的强度。加入P38、JNK和ERK信号通路抑制剂后，经P38、JNK和ERK信号通路抑制剂处理的细胞IL-1b和IL-18的mRNA表达水平与未处理细胞相比有显著差异。特别是，经SP600125(JNK抑制剂)处理后，IL-1b的mRNA表达水平升高(图E)，而IL-18mRNA的表达水平显著降低(图I)。经SB 203580(图F，J)和U0126(图G，K)抑制剂处理后，IL-1b和IL-18mRNA表达水平均下调，但IL-1b和IL-18mRNA表达水平无明显变化(图H，L)。
为了研究LMH细胞和1日龄雏鸡体内炎性小体的激活情况，作者检测了可能的NLRs和caspase-1的mRNA表达水平。到目前为止，已鉴定出五种类型的禽炎症体：NLRC3、NLRP3、NLRP5、NLRX1和NLRP1L。NLRC3、NLRC5和NLRX1的表达水平在4h时显著升高。与未感染的对照细胞相比，6h时LMH细胞的NLR活性显著增加(图A)。对未感染鸡的肝脏样本的相对表达水平的评估表明，所有NLR都有很大程度的上调(图B)。这些结果表明，炎性小体在戊型肝炎病毒感染诱导的炎症信号通路中起着调节作用。NLRX1是体内外表达上调最显著的基因。检测Caspase-1mRNA的表达，结果表明，在体外或体内，Caspase-1mRNA表达上调，并与LMH细胞的病毒感染呈剂量依赖关系(图C)。VX-765是一种高效、选择性的caspase-1抑制剂，可通过抑制caspase-1活性而有效地抑制IL-1b和IL-18的释放。体外实验确定VX-765对炎症反应的可能抑制作用。用Caspase-1特异性抑制剂VX-765(10 mmol/L，图D)处理LMH细胞2 h，然后用300TCID50剂量的YT株感染LMH细胞，6 h后收集细胞。作者发现NLRP3、NLRC3、NLRC5、NLRX1、NLRP1L、IL-1b和IL-18的表达水平随着抑制剂的处理而降低。因此，作者确定炎症通路的激活依赖于caspase-1(图E)。与caspase-1活性降低一致，VX-765处理的LMH细胞的NLR活性减弱(图F)。八、应用NF-kB和MAPK信号通路抑制剂解除对炎症体信号的调节在炎症过程中，MAPKs(JNK、ERK和p38)的磷酸化通过触发对NF-kB信号通路的调节而发挥关键作用。新的实验证据表明，MAPK和NF-kB在NLRP3的激活中都起着重要作用。例如，P38 MAPK信号通路可以通过显著增加caspase-1的裂解来介导NLRP3的上调。用JNK(SP600125)、P38(SB 203580)、ERK1/2(U0126)和NF-kB(PDTC)信号通路的阻断剂处理LMH细胞，与YT株共同孵育后，收集6h的细胞。以前，作者发现所有五条炎症途径都参与了YT感染诱导的验证反应，因此使用qRT-PCR对它们进行了检测。与未处理的LMH细胞相比，PDTC抑制剂处理后LMH细胞NLRP1L(P<0.01)和NLRX1(P<0.05)的表达下调。用JNK、p38和ERK1/2抑制剂抑制JNK和p38，以验证MAPK是否参与炎症小体的激活。JNK正向调节NLRP1L(P<0.01)、NLRP3(P<0.05)、NLRX1(P<0.01)和NLRP5(P<0.05)，但与NLRC3无关。提示P38 ERK信号通路可正向调节NLRP1L(P<0.01)、NLRC3(P<0.01)、NLRX1(P<0.01)和NLRP5(P<0.01)，与NLRP3无关。总之，越来越多的证据表明，宿主先天免疫对HEV感染有积极反应，无论是在实验模型中还是在患者中。YT株有效地诱导了肝脏和LMH中高水平的OASL，病毒感染在肝脏中比在LMH细胞中诱导更强烈的反应，此外，MDA5和炎症相关细胞因子在体内被激活,LMH细胞和肝脏中的MAVS基因表达水平下降。MAVS是推动对RNA病毒天然免疫的关键因素，病毒已进化出许多针对MAVS的拮抗策略以避免被宿主免疫系统检测,由于病毒感染后抗病毒蛋白的减少，MAVS调节对YT株的天然免疫反应的机制值得进一步研究。本文作者：闫振达
原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10098337/
DOI:10.3389/fimmu.2023.1161665
来源： ZhaoSunLab
