Nat Commun. | 在猪体内检测到基因I型和II型重组的高致死性非洲猪瘟病毒

2023-06-09 01:06

非洲猪瘟病毒(ASFV)对全球养猪业和食品安全构成巨大威胁。目前已报道了24种ASFV基因型，但目前尚不清楚在自然界中是否会发生不同基因型病毒的重组。在本研究中，作者在中国猪体内检测到三种基因型I和II型ASFVs的重组体。这些重组体在基因上相似，根据B646L基因被归类为基因I型，但它们有10个不连续的片段来自基因II型病毒，占其基因组的56%以上。对其中一种重组病毒的动物研究表明，该重组病毒在猪体内具有高致死率和传播性，删除来自强效基因II型病毒的毒力相关基因MGF_505/360和EP402R可显著降低其毒力。来自基因II型 ASFV的减毒活疫苗对重组病毒的攻击没有保护作用。这些自然发生的I型和II型ASFV重组有可能对全球养猪业构成威胁。

中国检测到I型和II型病毒基因组嵌合的重组ASFVs

作者从江苏省、河南省和内蒙古自治区采集的猪样本中分离出3株ASFV，分别命名为JS/LG/21、HeN/123014/22和IM/DQDM/22。根据B646L基因序列，将这些病毒鉴定为基因I型，但这些病毒均为HAD阳性，此前在中国检测到的基因I型病毒均为HAD阴性。ASFV的HAD阳性表型主要由EP402R基因编码的CD2v蛋白的完整性决定。测序发现它们的EP402R基因与中国第一株基因型II型分离株HLJ/18病毒具有100%的同源性，但与我国检测到的I型病毒SD/DY-I/21的同源性仅为81%。测序发现，这些新发病毒的B646L基因和EP402R基因分别来自基因I型和基因II型病毒。

为了进一步研究这些病毒的基因组组成，对其全基因组进行了扩增和测序，然后对这3种病毒和GenBank中可获得的8种不同基因型的56株参考病毒进行了系统发育分析。JS/LG/21、HeN/ 123014/22和IM/DQDM/22的基因组长度分别为185,431、185,395和185,342 bps，各自具有172个开放阅读框。这三种新出现的病毒在核苷酸水平上具有99.97 ~ 99.99%的同源性，在系统发育树中形成一个独特的分支，在基因型I和基因型II病毒之间聚集(图1a)。

我国已在田间检测到Georgia07-like II型和NH/ P68-like I型ASFVs。其代表分别为基因型II型病毒HLJ/18 (GenBank: MK333180)和基因型I型病毒SD/DY-I/21 (GenBank: MZ945537)，核苷酸同源性为97.38%。与SD/DY-I/21相比，HLJ/18的基因组有21,062 bp插入，4237 bp缺失，3840 bp突变。两种病毒在其基因组的编码区和非编码区均存在基因型特异性的单核苷酸多态性(SNPs)(图1b)。为了表征这三种重组ASFV的基因组特征，进行了重组分析，根据基因I型和II型asfv的特异性SNPs，确定重组病毒不同片段的可能亲本。详细比较发现，新病毒的10个大的离散基因组片段是基因I型病毒来源(图1c)，这些片段具有基因I型特异性SNPs(图1b)，与SD/ DY-I/21的同源基因组片段具有99.36-100%的一致性 (图1b)，但与HLJ/18的同源性为71.28-99.15%(表1和补充表1)。新病毒的另外10个基因组片段为基因型II型病毒来源(图1c)，因为它们具有基因型II型特异性SNPs(图1b)，与HLJ/18的同源基因组片段的同源性为99.95-100% (图1b)。与SD/ py -I/21的同源性为27.50 ~ 98.32%(表1和补充表1)。3个来自基因型I的新发病毒的10个片段的总长度为80,648 ~ 80,737 bps，占其基因组的43.51 ~ 43.54%。来自II型病毒的三种新发病毒的10个片段长度为104,694 bps，占其基因组的56.46-56.49%(表1和补充表1)。值得注意的是，三种新发病毒的基因型决定基因B646L均位于片段9 (F9)中，该片段来自I型病毒。而编码CD2v的EP402R基因位于片段6 (F6)，来自基因型II病毒(图1c);这就解释了为什么新型基因型I病毒具有had阳性表型。三个重组体的重组片段和所有ORF的信息显示在补充数据集1中。这些结果表明，这三种新出现的病毒是具有基因型I型和基因型II 型ASFV嵌合基因组的复杂重组病毒。

与亲本样病毒相比，重组病毒在其基因组中具有核苷酸突变、插入和缺失

将这三种新出现病毒的基因组与SD/DY-I/21和HLJ/18进行了比较。与SD/DY-I/21的同源片段相比，3个重组体在4个不同片段的6个ORF中均有8个单核苷酸突变，在B602L的ORF中插入一个96个核苷酸片段，在F1的非编码区出现1个单核苷酸突变、2个单核苷酸缺失和1个3个核苷酸缺失(图2a，b). JS/LG/21和HeN/123014/22在MGF_110-13/14L中均有C缺失。此外，JS/LG/21在编码区存在独特的单核苷酸突变和36核苷酸缺失。HeN/123014/22在三个ORF中有三个独特的单核苷酸突变，IM/DQDM/22在MGF_505-7R的ORF中有一个单核苷酸突变(图2a, b)。

与HLJ/18的同源基因组序列相比，这三个重组体有相同的单核苷酸突变，三个ORF中有两个单核苷酸插入(图2c)。JS/LG/21在MGF_100-1L的ORF中出现了唯一的单核苷酸突变。HeN/ 123014/22在四个ORF中有四个独特的单核苷酸突变，在F20的非编码区有五个独特的单核苷酸突变(图2c, d)。IM/DQDM/22在C475L的ORF中有一个独特的单核苷酸突变(图2c)。

与SD/DY-I/2病毒相比，基因I型病毒基因组片段中核苷酸的插入和缺失导致重组IM/DQDM/22病毒的一个ORF和重组JS/ LG/21和HeN/123014/22病毒的两个ORF发生改变。与HLJ/18病毒相比，基因型II型病毒的基因组片段中的核苷酸插入导致三种重组病毒的两个ORF发生改变。

重组病毒JS/LG/21具有高致死率和高致病性并在猪体内传播

新重组病毒高毒力基因II型病毒的10个分离片段具有106个ORFs（图1)。值得注意的是，这些基因中有一些是毒力决定因素，如EP402R基因和MGF_505/360区域的6个基因(MGF_505-1R、MGF_505-2R、MGF_505-3R、MGF_360-12L、MGF_360-13L、MGF_360-13L、MGF_505-1R)。和MGF_360-14L)。为研究来自致死基因型II型病毒的基因是否与重组ASFV的致病性和传播力有关，JS/LG/21 注射6组7周龄的SPF猪10³HAD50 或10⁶ HAD50。每组接种猪与未接种的猪共养2头，以评估病毒的传播能力。每天监测猪的临床体征。从接种后第3天开始，每隔一天采集全部猪的口腔、直肠拭子和血液，用qPCR检测病毒和病毒血症。

在接种10⁶ HAD50组中，所有6头接种的猪在第4天开始发烧，并在第5天和第8天之间死亡(图3)。在所有接种猪和接触猪的口腔拭子、直肠拭子和血液中检测到病毒DNA(图3)。在器官中也检测到高水平的病毒DNA，包括大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和扁桃体，以及三个不同的淋巴结(腹股沟淋巴结、颌下淋巴结、和纵隔淋巴结)(图3)。10³ HAD50组，接种的猪在第4天出现发烧，所有的猪在第6天至第15天死亡(图3)。接触猪分别在第9天和第10天开始出现发烧。其中一人在第12天死亡。另一个死于第14天(图3)。在所有接种猪和接触猪的口腔和直肠拭子、血液和所有器官中也检测到病毒DNA，尽管水平略低于10⁶ HAD50组。这些结果表明，重组病毒JS/LG/21在猪体内具有高致死率和传染性。

MGF_505/360基因和EP402R基因来源于Georgia07-like基因II型病毒导致了重组病毒在猪体内的高毒力

许多基因已被证明对ASFV的毒力起重要作用(补充表4)。前期研究表明，MGF_550 /360和EP402R是基因I型和II型ASFV的重要毒力因子。NH/ p68样基因型I型病毒对猪的毒力较低,而Georgia07-like II型病毒对猪具有高度致命性。3株重组病毒的基因组中，43.5%来自NH/ P68样基因I型病毒，56.5%来自Georgia07-like基因型II病毒。重组病毒在猪体内的致死率与Georgia07-like II型病毒相同。MGF_505/360和EP402R基因在NH/ p68样病毒中是天然缺陷的。在这项研究中，这三种分离株含有MGF_505/360基因和EP402R基因，该基因来源于高致死率的Georgia07-like II型病毒。

为了确定MGF_505/360和EP402R基因对重组菌株毒力的影响，将缺失EP402R、MGF_505-1R、MGF_505-2R、MGF_505-3R、MGF_360-12L、MGF_360-13L和MGF_360-14L基因的重组JS/LG/21菌株转化为同源重组的Venus和mCherry基因。合成的病毒设计为JS/LG/ 21-7GD (图4a)。JS/LG/21-7GD在PAMs中的生长动态与其亲本病毒JS/LG/21相似(图4b)， JS/LG/21- 7GD感染PAMs后72 h可观察到Venus和mCherry的荧光(图4c)。采用肌内接种10⁶ TCID50 JS/LG/21-7GD对SPF猪进行致病性试验。10头接种的猪均无发热，无ASFV相关临床症状(图4d)， 28天观察期均存活(图4e)，并产生大量ASFV特异性抗体(图4F)。提示II型病毒MGF_505/360基因和EP402R基因是JS/LG/21的重要的毒力基因。

重组病毒JS/LG/21可通过基因II型ASFV减毒活疫苗逃避免疫诱导

先前的研究表明，在低毒力ASFV感染后存活的猪体内会产生保护性免疫，提供了对同源病毒攻击的抗性，但对异种病毒攻击没有抵抗力。通过删除6个MGF_550 /360基因和编码CD2v的EP402R基因，获得了一株减毒活疫苗HLJ/18-7GD，该疫苗在猪身上的研究证明了该疫苗对基因型II型ASFV的安全性和有效性。第28天的接种疫苗后，每组5只SPF猪分别肌肉注射10⁶ TCID50 HLJ/ 18-7GD，肌注10³ TCID50 重组病毒JS/LG/21或基因II型病毒HLJ/18。由4头未接种疫苗的猪组成的一组作为对照组。

对照组猪在HLJ/18攻毒后10天内出现高热，并全部死亡，主要器官和淋巴结中检测到病毒DNA(图5)。相比之下，接种疫苗的猪对同源病毒HLJ/18攻毒的保护效果较好:在28天的观察期中，猪均未出现临床症状，且全部存活(图5)，但在用重组病毒JS/LG/21攻毒的对照组猪在攻毒后8天内发热死亡，主要器官和淋巴结中检测到病毒(图5); 然而，所有接种疫苗的猪也出现发烧，并在攻毒后10天内死亡(图5)，这些结果表明，减毒活疫苗HLJ/18-7GD不能对新出现的重组ASFV提供保护。