PLOS Pathogens|夏宇尘课题组揭示乙肝病毒通过多泡体出胞的分子机制

2023-05-29 02:05

近日，病毒学国家重点实验室/武汉大学基础医学院/武汉大学泰康生命医学中心夏宇尘教授课题组在国际学术期刊PLOS Pathogens在线发表题为“Hepatitis B Virus hijacks TSG101 to Facilitate Egress Via Multiple Vesicle Bodies”的研究论文。该研究使用免疫沉淀-液质联用质谱技术筛选出潜在的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）出胞调控因子TSG101。通过细胞和动物模型确认该分子在HBV分选入多泡体出胞过程中发挥核心功能，并对详细分子机制进行了探究。

全球HBV慢性感染者已达到2.96亿人，但现有治疗手段很难彻底清除病毒感染。全面深入的解析病毒复制的分子机制是抗病毒新靶点发掘的基础。在HBV感染晚期，病毒颗粒组装后离开细胞。其中，HBV的完整病毒颗粒（Dane颗粒）通过多泡体（multiple vesicle body,MVB）释放出胞，这对于病毒感染传播至关重要。现有实验证据表明HBV病毒粒子组装分泌过程为：核衣壳被运输到MVB表面，随后通过运输所需的内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport, ESCRT）作用出芽入MVB，最终MVB和/或MVB衍生的囊泡与质膜融合后释放出HBV病毒粒子。然而，目前尚不清楚哪些宿主因子参与以及如何识别HBV核衣壳、并促进HBV病毒粒子的成熟及出胞。

为解决这一关键科学问题，夏宇尘教授课题组使用免疫沉淀富集HBV衣壳蛋白（HBV core protein,HBc）潜在互作宿主因子，并使用液质联用质谱技术对这些因子进行鉴定。通过生物信息学分析与siRNA筛选，研究人员发现TSG101为调控HBV复制的潜在宿主因子。在HBV复制细胞模型、病毒感染细胞模型和HBV转基因小鼠模型中，敲降该基因能显著抑制病毒核酸的分泌而增加胞内的病毒核衣壳含量。通过透射电镜和聚焦离子束-扫描电镜技术观察到HBV能够促进多泡体成熟，而TSG101的敲降能够明显抑制这一过程。进一步通过免疫电镜观察确认敲降该基因能够抑制病毒在多泡体中的富集。利用CsCl密度梯度离心和免疫沉淀分离，研究人员进一步确认TSG101影响完整成熟病毒颗粒的分泌。

在此基础上，研究人员探究了TSG101分选病毒核衣壳并调控病毒出胞的详细分子机制。TSG101是一个具有泛素识别功能的分子，其泛素E2样变体(ubiquitin-E2-like variant, UEV)结构域突变体失去与HBc互作能力、也不再支持病毒出胞。以上结果提示在出胞过程中HBc很可能发生了泛素化。通过对不同基因型HBV序列比对，研究人员发现HBc有K7和K96两个保守的赖氨酸位点。点突变实验进一步揭示K96位点的突变会导致HBc无法与TSG101互作，同时在不影响核衣壳组装的情况下病毒出胞受阻。既往研究表明TSG101识别的泛素化蛋白通常含有PPxY基序。通过序列分析研究人员发现HBc含有保守的PPxY序列，而其突变会影响HBc与TSG101互作及病毒出胞。

为了进一步回答HBc如何发生泛素化这个科学问题，研究人员通过siRNA筛选发现NEDD4可能是参与这个过程的E3泛素连接酶。NEDD4的敲降或其HECT结构域的突变会引起病毒分泌受限。而细胞内及体外实验表明NEDD4通过HBc的PPxY基序介导其K96位点泛素化，进而促进TSG101的识别。

TSG101分选HBV核衣壳进入多泡体促进病毒粒子的形态发生及分泌的分子机制示意图。

综上所述，TSG101识别泛素化的HBc蛋白,使HBV利用MVB路径出胞。HBc蛋白的泛素化由E3泛素连接酶NEDD4介导。NEDD4通过PPxY基序被HBc蛋白募集,并对HBc蛋白进行K96位泛素化。TSG101通过其VFND序列（UEV结构）与泛素化的HBc结合，并介导病毒颗粒的出胞。病毒粒子释放是HBV持续感染的重要步骤，而本研究揭示了TSG101在病毒出胞过程中的核心作用，为抗病毒药物研发提供了新的靶点。

该研究得到国家自然科学基金(81971936)、湖北省医学青年拔尖人才、湖北省创新研究群体（2020CFA015），中央高校基本科研业务费专项资金等项目资助。武汉大学基础医学院博士后郑颖城、硕士生王梦飞和博士生李四通为该论文共同第一作者，夏宇尘教授为通讯作者。

全文链接：https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1011382

夏宇尘教授2018年通过海外高层次人才计划回国后一直致力于病毒性肝炎的研究，在乙肝病毒实验模型的建立、病毒宿主相互作用机制和新型抗病毒治疗手段上做了一系列的工作，作为通讯作者在Journal of Hepatology, Hepatology, Nature Metabolism, Plos Pathogens, Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology，Journal of Virology，Antiviral Research等学术期刊发表多篇论文。实验室招收博士后1-2名，详情请联系[email protected]。

来源：Bioon细胞

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