Science | 何跃辉团队揭示核定位的α-酮戊二酸脱氢酶复合体调控组蛋白去甲基化的分子机制

在真核生物中，组蛋白甲基化修饰在调控染色质结构、基因转录和其他染色质相关过程中起着重要作用 (Jambhekar et al., 2019)。常见的甲基化修饰位点包括组蛋白H3的第4、9、27、36和79位，以及组蛋白H4的第20位赖氨酸。这些甲基化修饰的添加和去除由组蛋白赖氨酸甲基转移酶（KMT）和组蛋白赖氨酸去甲基化酶（KDM）催化完成，并受内源与环境因素调控 (Black et al., 2012; Jambhekar et al., 2019)。

进化保守的含有Jumonji C（JmjC）结构域的去甲基化酶家族（Jumonji C-containing histone demethylases, JMJs）是真核生物中的主要组蛋白去甲基化酶。JMJs利用α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG) 和氧分子作为辅助底物，通过氧化脱羧反应去除组蛋白赖氨酸残基上的甲基化修饰基团。通常情况下，细胞质中的α-酮戊二酸通过核孔扩散进入细胞核，在JMJs介导的组蛋白去甲基化过程中起必需的作用 (Kooistra and Helin, 2012; Schvartzman et al. 2018)。因此，细胞核内局部α-酮戊二酸浓度的变化理论上有可能影响JMJs的活性。然而，我们对于JMJ周边的 α-酮戊二酸浓度是否受到精准调控以及这种调控是否受环境影响，完全未知。

2023年7月14日，北京大学现代农学院（小麦生物育种全国重点实验室）、北京大学现代农业研究院、北大-清华生命科学联合研究中心何跃辉研究组在Science在线发表了题为"Control of histone demethylation by nuclear-localized α-ketoglutarate dehydrogenase"的研究长文，报道了三羧酸循环（TCA Cycle）的限速酶α-酮戊二酸脱氢酶复合体（α-ketoglutarate dehydrogenase, KGDH）响应光信号进入细胞核，并与JMJs蛋白互作；KGDH通过竞争性代谢α-酮戊二酸，抑制了JMJs的组蛋白去甲基化活性，从而在全基因组水平调控组蛋白的甲基化修饰进而调控一系列环境响应基因表达的分子机制。

原核和真核生物的α-酮戊二酸脱氢酶复合体是线粒体呼吸作用-三羧酸循环过程中的限速酶，起着将α-酮戊二酸氧化脱羧转变为琥珀酰辅酶A的重要功能 (Nunes-Nesi et al., 2013)。何跃辉团队通过正向或反向遗传学方法获得了拟南芥KGDH两个亚基E1（oxoglutarate dehydrogenase, OGDH1和OGDH2）和E2（dihydrolipoamide succinyltransferase, E2a和E2b）的功能缺失突变体。研究结果表明，这些突变体尤其是E1的双突变体表现出明显的延迟开花和花青素积累的表型，并且影响了TCA循环的中间代谢物的水平，呼吸作用受到了抑制。尽管α-KG作为JMJs的辅助底物能够通过影响JMJs的酶活性进而调控基因表达，但考虑到α-KG含量在ogdh1 ogdh2双突变体中显著增加，而在e2a突变体中基本没有变化，所以细胞内α-KG整体水平的变化并不是导致ogdh1/2和e2a突变体产生表型的直接原因。研究人员猜测少量KGDH可能进入细胞核发挥作用。哺乳动物的一些细胞中发现少量TCA循环的酶进入细胞核 (Nagaraj et al., 2017; Wang et al., 2017)，但是在植物中是否存在类似现象仍未知。

通过荧光蛋白标记以及核质蛋白分离与检测等方法，研究人员发现少量KGDH的三个亚基存在于拟南芥细胞核中，并且在细胞核中检测到了KGDH全酶的催化活性，这说明植物细胞核内存在完整且具有活性的KGDH。有趣的是，在幼苗中，光信号促进KGDH进入细胞核。进一步，研究人员通过核定位信号序列预测工具NLStradamus发现拟南芥的两个E2蛋白都具有核定位信号，并且在E2a和E2b的单突变体中，OGDH1进入核内的量显著减少，这表明KGDH入核是通过E2亚基实现的。作者还分析了绿藻、苔藓、酵母和果蝇的E2蛋白，发现这些蛋白都存在核定位信号。当核定位信号序列发生突变后，E2蛋白失去了进入细胞核的能力，并且线粒体定位的E2a不能回补e2a突变体的表型，这表明核内KGDH具有重要的生物学功能。

由于α-KG是JMJs催化去甲基化的必需辅助底物，而KGDH可以降解α-KG，所以核内的KGDH可能通过与JMJs竞争并降解α-KG进而抑制JMJs的活性。研究人员检测了KGDH突变体中的组蛋白甲基化修饰情况，发现在E1的双突变体ogdh1/2及E2的两个单突变体中，去甲基化主要由JMJs催化的修饰包括H3K4me3、H3K9me2、H3K27me3和H3K36me3，其水平都显著下降了，而去甲基化由不需要α-KG的去甲基化酶LSDs催化的H3K4me1与H3K4me2、其水平没有明显变化。有趣的是，仅定位于线粒体的E2a既不能回补e2a突变体的表型也不能回复e2a突变体的组蛋白甲基化水平的变化，暗示核内KGDH通过控制核内局部的α-KG浓度来调控JMJs的酶活性，从而影响了组蛋白的去甲基化水平。

研究人员进一步用ChIP-seq的方法检测了ogdh1/2双突变体和野生型的H3K27me3在全基因组水平的分布情况，发现在突变体中基因编码区域的H3K27me3的水平显著下降了。同时通过RNA-seq的方法，作者检测了在ogdh1/2双突和e2a中较野生型差异表达的基因，发现在突变体中差异表达的基因存在显著的重叠，并且环境应答或激素响应基因在差异表达基因中富集，比如非生物胁迫、红光及远红光响应基因、脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）响应基因。此外、涉及开花调控的关键转录因子FLOWERING LOCUS C（FLC）以及花青素合成关键转录因子PRODUCTION OF ANTHOCYANIN PIGMENT 1（PAP1）在突变体中都显著上调，解释了KGDH突变体晚花和花青素积累的表型。更有趣的是，这些差异表达的基因大部分都是受到组蛋白甲基化修饰调控，突变体中上调表达的一部分基因被转录抑制型的H3K27me3修饰，而下调基因的一部分被转录激活型的H3K4me3修饰，进一步证实了KGDH复合体与组蛋白甲基化修饰的关系。

因为核内KGDH通过抑制JMJs的功能来调控组蛋白甲基化，研究人员进一步检测了KGDH与JMJs直接互作的可能性。通过酵母双杂交，Co-IP以及BIFC等方法，作者发现KGDH的OGDH1与H3K27去甲基化酶（ELF6，REF6和JMJ13），H3K4去甲基化酶JMJ14以及H3K9去甲基化酶IBM1等蛋白互作。考虑到KGDH和JMJs在真核生物的保守性，作者探索了哺乳动物的KGDH与JMJs蛋白互作的可能性，结果发现人类和老鼠的OGDH与JMJ去甲基化酶KDM4A互作，这说明KGDH通过直接与JMJs蛋白互作然后抑制其活性可能是真核生物界保守存在的一种调控机制。全基因组ChIP-seq实验进一步证明，OGDH主要富集在组蛋白甲基化修饰（如H3K4me3、H3K27me3）发生的区域。因为KGDH复合体中没有与DNA或者组蛋白结合的组分，OGDH在染色质上的富集有可能是通过JMJs实现的。作者从OGDH1富集的位点中选择了六个在ogdh1/2突变体中异常表达的基因，通过ChIP-qPCR的方法，发现上调表达的基因直接受到H3K27去甲基化酶ELF6的调控，并且ELF6在基因上富集的区域与OGDH1相同，而下调表达的基因直接受到H3K4去甲基化酶JMJ14的调控。进一步的研究发现OGDH1在ELF6结合位点的富集依赖ELF6蛋白。作者最后聚焦KGDH和ELF6调控PAP1表达的分子机制，发现KGDH通过降低PAP1位点的α-KG浓度，抑制ELF6的H3K27去甲基化活性，从而抑制PAP1基因的表达及花青素的合成。

图1. 光照促进与TCA循环相关的酶KGDH进入植物细胞核，调控JMJs的组蛋白去甲基化酶活性（Huang et al. Science 2023）。

综上所述，该研究揭示了一个全新的组蛋白去甲基化酶活性的调控机制，即TCA循环的限速酶KGDH能进入细胞核，并且这个过程在植物中受光调控；核内KGDH与多个JMJs互作，通过催化α-酮戊二酸的氧化脱羧，竞争性地抑制了JMJs的去甲基化活性，从而调控了基因组范围内的组蛋白甲基化水平，进而激活或抑制靶基因表达。核内KGDH与JMJs的互作在哺乳动物细胞中也被发现，表明这一调控机制保守存在于真核生物界。

论文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.eadf8822