Cell | 陈建军/苏瑞/夏强团队报道首个mRNA内部m7G甲基化修饰识别蛋白

2023-07-03 16:07

表观转录组学（Epitranscriptomics）主要聚焦RNA所携带的化学修饰对基因表达的影响。目前已有大约170种不同的化学修饰被发现存在于多种类型的RNA中，其中6-甲基腺嘌呤 (m⁶A) 修饰是信使RNA (mRNA) 上丰度最高的内部修饰。RNA修饰的生物学功能发挥在很大程度上依赖其特定的识别蛋白（阅读器；reader）。以m⁶A修饰为例，YTHDF蛋白家族【1,2】、YTHDC蛋白家族 【3】、IGF2BP蛋白家族【4】等均可特异性识别mRNA上的m⁶A位点，从而调控mRNA代谢（mRNA metabolism）（链接：『珍藏版』Mol Cell综述 | m6A背景依赖性功能的实现）。除m⁶A之外，mRNA上还存在着众多其他种类的化学修饰，例如1-甲基腺嘌呤 (m¹A)、5-甲基胞嘧啶 (m⁵C)、7-甲基鸟嘌呤 (m⁷G) 等【5-7】。2019年，美国芝加哥大学的何川教授和英国剑桥大学的Tony Kouzarides教授在同期Molecular Cell上发表了其研究成果【7-9】，证实了m⁷G修饰存在于哺乳动物mRNA和miRNA的内部，并报道了METTL1-WDR4复合体作为相应的甲基化转移酶（链接：Mol Cell背靠背 | 何川团队报道mRNA与miRNA上存在m7G甲基化修饰）。同时，中国科学院北京基因组研究所杨运桂教授开发了新的检测技术，获得了mRNA内部m⁷G修饰 (mRNA internal m⁷G modification) 的高分辨率图谱。然而迄今为止，mRNA内部m⁷G修饰的特异性识别蛋白尚不清楚，这极大地阻碍了对mRNA内部m⁷G修饰功能的研究。因此，鉴定mRNA内部m⁷G修饰的特异性识别蛋白具有十分重要的意义。

2023年6月27日，美国希望之城国家医疗中心（City of Hope National Medical Center）的陈建军教授、苏瑞助理教授及上海交通大学医学院附属仁济医院的夏强教授合作，在Cell上发表题为 QKI shuttles internal m⁷G-modified transcripts into stress granules and modulates mRNA metabolism 的研究文章，筛选并鉴定出mRNA内部m⁷G修饰的首个识别蛋白QKI (Quaking)，而且报道了在应激状态下QKI对细胞应激颗粒内具有m⁷G修饰mRNA的动态调控作用。

研究者首先验证了METTL1-WDR4甲基转移酶复合体对mRNA内部m⁷G的修饰作用。与此前的报道一致【7,10】，敲除METTL1/WDR4显著降低small RNA和mRNA内部m⁷G的丰度；过表达野生型METTL1可增加small RNA和mRNA内部m⁷G的水平。除此之外，研究者还发现细胞质mRNA上的m⁷G总体丰度大于细胞核mRNA。为了筛选mRNA内部m⁷G修饰的特异性识别蛋白，研究者利用体外转录技术（in vitro transcription）合成了两条仅含有G或m⁷G的单链寡核苷酸 (ssRNA) ，并将其与HepG2全细胞裂解液进行孵育，利用RNA pull down和质谱技术联合分析，鉴定出能特异性识别m⁷G-ssRNA的RNA结合蛋白。eCLIP-seq数据库分析结果表明，在QKI、IGF2BP2和LRPPRC这三个候选蛋白中，只有QKI含有与METTL1类似的GA-GA-基序（motif），这一序列也正好是先前报道的mRNA内部m⁷G修饰基序。QKI是STAR蛋白家族的一员，主要包含QKI5、QKI6和QKI7三个亚型。细胞内（in cellulo）和细胞外（cell-free）RNA pull-down实验表明QKI5、QKI6与QKI7均倾向与含有内部m⁷G修饰的ssRNA结合。接着研究者综合分析了m⁷G甲基化RNA测序（MeRIP-seq）以及QKI5/QKI6/QKI7 RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）的数据，发现两者都具有类似的GANGAN（N=A/C/U/G）基序。此外，METTL1敲除可以显著抑制QKI与靶mRNA的结合，提示QKI与靶mRNA的结合至少部分依赖于METTL1所介导的内部m⁷G修饰。

此前的研究发现，活性氧和热应激刺激可动态调控mRNA内部m⁷G修饰的水平【11】，但其背后的机制并不明确。在各种应激源的刺激下，细胞质内RNA、蛋白翻译复合物和RNA结合蛋白通过液-液相分离组装成无膜细胞器结构，称为应激颗粒（stress granule）【12-14】。应激颗粒将特定的蛋白质和mRNA分子与细胞质分隔开来，对应激状态下mRNA的代谢起到了关键的调节作用。G3BP1（G3BP stress granule assembly factor 1）是上述应激颗粒中RNA-蛋白互作网络中的核心调控分子【15】。研究者通过免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光（immunofluorescence Staining）和邻位连接技术（proximity ligation assay, PLA）等检测方法发现QKI6和QKI7可以与G3BP1发生相互作用。在正常情况下，具有m⁷G修饰的mRNA分布于细胞质内；而在应激状态下，具有m⁷G修饰的mRNA会向应激颗粒内聚集。QKI 敲低显著降低应激颗粒内具有m⁷G修饰mRNA比例，野生型QKI7过表达可以大体上恢复这一表型。上述实验结果提示，应激状态下QKI可以识别并结合具有内部m⁷G修饰的mRNA，通过与G3BP1发生相互作用从而将靶mRNA限制在应激颗粒内。那么，QKI将靶mRNA携带至应激颗粒之后，对其代谢有何影响呢？为了回答这一问题，研究者综合分析了应激状态下m⁷G MeRIP-seq、QKI7 RIP-seq以及SG RNA-seq的数据。测序结果同样提示，具有m⁷G修饰并能与QKI7结合的mRNA更倾向在应激颗粒中聚集。KEGG通路分析表明这些基因多富集在“Hippo signaling pathway”和“pathway in cancer”两个通路。接下来研究者开展了mRNA稳定性测序（mRNA stability profiling）和多聚核糖体分析（Polysome profiling），实验结果表明，在应激状态下QKI可以调控Hippo 信号通路关键基因等靶基因的稳定性和翻译效率。

应激颗粒对肿瘤细胞在极端环境下的生存至关重要。长春新碱、紫杉醇、索拉菲尼等常用化疗药物均可诱导肿瘤细胞形成应激颗粒。TCGA数据库分析表明，QKI与各种应激颗粒关键基因的表达均存在显著的正相关性。研究者进一步研究发现阿霉素（doxorubicin）也可诱导肿瘤细胞形成应激颗粒，且QKI7与G3BP1共同定位于阿霉素诱导形成的应激颗粒中。体内外实验表明，QKI7过表达可显著增强肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，提示应激颗粒对肿瘤化疗耐药的作用可能与mRNA内部m⁷G修饰有关。综上，该研究揭示了QKI作为mRNA内部m⁷G修饰识别蛋白的新功能，对应激颗粒内部mRNA的调控网络提出了新的机制，并为靶向QKI/G3BP1从而优化肿瘤治疗这一新策略提供了理论依据。

美国希望之城国家医疗中心赵之聪博士，卿莹博士和董磊博士为本文的共同第一作者；陈建军教授，苏瑞助理教授以及上海交通大学医学院附属仁济医院夏强教授为本文的共同通讯作者。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.05.047

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来源：BioArt

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