不靠专利授权，我们还能继续做DNA甲基化检测吗？

我们依然处在谈癌色变的年代，每天约1万人确诊为癌症，70%的患者初诊已是中晚期，预后不佳。在国家对肿瘤防治的系列措施中，肿瘤早期筛查获得越来越多人的关注，也被寄予更高的期待。

虽然已经存在的部分肿瘤早筛检测技术被广泛应用，但其中也隐含越来越多的问题。例如，用于检测肺部结节的低剂量螺旋CT的应用存在对高危人群定义标准不一、假阳性率过高、过度诊断和成本效益等问题；而基于血浆ctDNA 的NGS基因突变检测已经被证明无法有效进行肿瘤的筛查和复发监测；循环肿瘤细胞（CTC）检测早先被寄予厚望，但其检测敏感度始终困扰其终端用户，其特异性高被认为是CTC检测的优势也随着CTC技术的推广应用也引起越来越多的争议，需要进一步探讨和确认。

众所周知，我们国家的肿瘤五年生存率仅为发达国家的一半左右，而如果将肿瘤诊断在超早期，即前癌阶段，则5年生存率中国和美国相同，均可以达到100%，然而很遗憾，目前国内外没有一个公认的肿瘤超早期诊断的标志物。

因此，寻找敏感性及特异度更高，更加精准、无创、简便、可重复性高，且能将检出时间提前至癌前病变阶段的肿瘤早期诊断技术是临床亟待解决的问题。

如果要在癌前病变或肿瘤早期就及时、准确地筛查出肿瘤，DNA甲基化检测是目前公认最好的方式之一。肿瘤DNA甲基化标志物的筛选也成为目前研究的热点，欧美国家每年都会涌现一批新的甲基化标志物，并推进相应的临床转化。

我国肿瘤早筛市场，不乏基于DNA甲基化的早筛产品。早筛市场看似红火，但从知识产权角度来看，我国尚缺少具有独立知识产权的肿瘤甲基化标志物，国内甲基化检测产品多数要获得国外专利授权才能进行开发。从国内已获批的甲基化检测产品看，目前已有的17种甲基化检测试剂盒中，就有10个试剂盒的检测适应症为结直肠癌，甲基化检测产品竞争格局出现一定的同质化现象。

近日，上海奕谱生物科技有限公司（以下简称“奕谱生物”）传来好消息，由奕谱生物自主研发的基于全癌标志物的尿路上皮癌DNA甲基化检测产品“TAGMe DNA Methylation Detection Kit (qPCR) for Urothelial Cancer”（国内商标名：滂奕清）获得FDA突破性医疗器械（Breakthrough Device）认证，成为全球首个获得美国FDA突破性医疗器械认定的自主研发的基于全癌标志物的尿路上皮癌（膀胱癌、输尿管癌和肾盂癌）尿液同步检测产品。公开资料显示，要获得FDA突破性医疗器械认定，申请的检测器械必须解决未实现的医疗需求，并证明其具有可能危及生命或不可逆转的衰弱性疾病或病症提供更有效的治疗或诊断。

更令人惊喜的是，奕谱生物具备57个独有的全癌标志物，共申请了32项国内专利和36项国际专利，其中14项已获批！这些标志物填补国内DNA甲基化标志物空白和推动国内甲基化检测的临床应用研究发挥了重要作用。那么，到底是什么因素制约了我国DNA甲基化标志物的发现，使我国在这一领域中如此滞后呢？

DNA甲基化主要是指DNA脱氧核苷中的胞嘧啶（C）在酶的作用下共价结合甲基基团形成5'-甲基胞嘧啶的过程。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性等发生改变，从而调控基因的转录和表达。

1983年，美国约翰霍普金斯的Andrew Feinberg发现肿瘤细胞中存在全基因组的DNA低甲基化现象，第一次将DNA甲基化与肿瘤联系起来；1985年，Stephen Baylin发现肿瘤抑制基因的启动子高甲基化导致了肿瘤抑制基因的沉默，一时间肿瘤的DNA高甲基化成为肿瘤表观遗传学研究的热点，而肿瘤低甲基化研究则陷入低谷。

直到1998年，Andrew Feinberg发现肿瘤细胞的全基因组DNA低甲基化会导致基因组不稳定，从而解释了肿瘤DNA低甲基化与肿瘤发生的内在关系，至此人们才认识到肿瘤全基因组的DNA低甲基化和局部高甲基化共同参与了肿瘤的发生。

此后大量的研究表明，DNA的异常甲基化通常发生在肿瘤的超早期，是肿瘤发生的开关。基因组启动子区的甲基化会改变细胞重要的肿瘤抑制基因的表达，是导致肿瘤发生的原因之一。随着肿瘤发展的推进，DNA甲基化也会随之动态改变，且不同肿瘤的DNA甲基化图谱也存在明显的差异，这些发现都为DNA甲基化用于肿瘤检测打开了新的路径。

2001年，于文强教授在第四军医大学获得博士学位后，来到瑞典乌普萨拉大学和美国约翰霍普金斯大学进行博士后研究。在美国约翰霍普金斯大学留学期间，于文强教授师从Andrew Feinberg进行表观遗传学研究，建立了快速微量梯度增温的ChIP DNA 扩增技术和以磁珠吸附为基础的DNA甲基化片段富集技术，同时发现肿瘤抑制基因的反义序列是诱导基因沉默的关键原因。2009年，于文强教授回到复旦大学担任博士生导师，并受聘成为长江学者特聘教授及中国抗癌协会甲基化肿瘤标志物委员会主任委员等。

从凝胶电泳到芯片杂交，再到高通量测序技术，多种甲基化检测方法不断帮助研究者发现更多肿瘤相关的基因组内异常的甲基化位点。但全基因组DNA甲基化检测中始终有一个问题难以解决，即传统的DNA甲基化测序都依赖于基因组DNA的亚硫酸盐转化和预处理，造成基因组DNA的复杂度大幅下降，无法比对到人体参考基因组，大量的人体CpG位点的甲基化信息缺失，无法获得全基因组所有CpG 位点的甲基化信息全景图。目前通用的甲基化检测方法包括基因芯片、简化基因组甲基化测序 (RRBS)和全基因组甲基化测序（WGBS）等需要大幅改进或优化。

甲基化全基因组测序分析方法（不完全统计） 动脉网制图

即使是WGBS技术也仅能覆盖肿瘤细胞全基因组50%左右胞嘧啶，加之早期WGBS成本极高，境外机构或研究者利用该技术不断在甲基化检测位点发现上取得突破，并注册大量的标志物专利，使得在国内基于WGBS发现新甲基化标志物并注册知识产权显得困难重重，留给我们自己的可用标志物越来越少，推进脚步也不断滞后。

甲基化检测位点（按知识产权登记统计，不完全） 动脉网制图

工于善其事，必先利其器。要找到肿瘤DNA甲基化标志物，那必须拥有先进的全基因组甲基化测序技术和完善的研究方案。于文强教授团队在DNA 甲基化领域深耕二十余年，在此期间开发了全新的拥有自主知识产权的全基因组 DNA 甲基化检测方法GPS (Guide Positioning Sequencing)，即“导向定位测序”。

该测序技术突破WGBS技术比对率低的瓶颈，GPS技术将CpG岛的检测覆盖率提高到96%^[1]，并绘制全球首个单碱基精度的全基因组DNA甲基化图谱，GPS 技术大大提高DNA 甲基化测序的准确性。基于GPS 技术对全基因组DNA高精度和高覆盖度的甲基化检测，籍此，于文强教授团队找到了在肿瘤中共有的一类甲基化位点，并在全球首次提出“全癌标志物” (Universal Cancer Only Marker, UCOM) 概念^[2]，进而发现了一系列TAGMe^®全癌肿瘤标志物^{[3, 4]}，目前已发现57个全癌标志物检测靶标。截至2023年5月，这些全癌肿瘤标志物已完成8万例临床样本双盲验证，组织样本总体符合率达90%。

通过大量临床样本的检测和验证，于文强教授团队与合作者一起发现全癌标志物的三个重要特征。第一，全癌标志物具有全或无的特点，即正常组织中全癌标志物甲基化正常，而在肿瘤组织中却存在该标志物的高甲基化。第二，全癌标志物是一个恶性肿瘤标志物，该标志物专属于恶性肿瘤细胞，全癌标志物的检测不易受机体其他因素影响。第三，全癌标志物甲基化异常早于病理细胞形态学变化，代表着全癌标志物能在“前癌”阶段检测肿瘤。利用全癌标志物能够实现一次检测多种肿瘤，可以实现肿瘤检测的流程化，标准化和自动化。据研究团队透露，目前已经完成肿瘤溯源的研发，可以实现12种肿瘤的精准定位并已在临床中验证，其组织溯源准确率大于80%。

GPS技术对每条染色体上胞嘧啶覆盖率 ≥90%   奕谱生物供图

全球首个单碱基精度的全基因组DNA甲基化图谱

全基因组总胞嘧啶覆盖率>96%

奕谱生物供图

发现全癌标志物只是其应用于肿瘤早筛的第一步，并不代表就能把肿瘤的检测做好。因为传统的DNA甲基化检测技术存在诸多缺陷，导致甲基化标志物在真实世界的临床应用中遇到很多问题，检测结果的稳定性困扰这整个甲基化检测领域的诸多从业者。目前常用的DNA甲基化标志物检测方法有甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐修饰后测序、荧光定量法等。

特异点位甲基化检测方法汇总^[5]  （资料来源参考文末注释）

近年来，市面上已经出现了十多种甲基化检测方法，其检测过程也多用到亚硫酸盐进行预处理。在此过程中，运用亚硫酸盐处理需要耗费大约2.5小时，纯化也需要1小时左右。同时，其全程需要人工处理，操作时间长，是甲基化检测重要限速步骤，难以适应医院检验科的高通量流转的要求。最关键的问题是亚硫酸盐处理不完全会导致检测结果出现假阳性，而亚硫酸盐处理恰恰是DNA甲基化检测中最不容易做且痛点指数最高的步骤之一。

传统的DNA甲基化检测方法存在亚硫酸盐转化不稳定、操作复杂、检测时间长、样本假阳性率高、技术人员依赖性高等问题。因此奕谱生物自2018年成立之初就致力于解决DNA甲基化检测所面临的诸多问题，经过攻坚克难自主研发了全球首项不依赖于亚硫酸盐处理的，基于qPCR平台的DNA甲基化检测方法——Me-qPCR。

Me-qPCR技术具有以下优势：

Me-qPCR技术彻底摆脱了重亚硫酸盐处理的限制，让甲基化检测在真实世界中的应用做到稳定且准确。对比使用重亚硫酸盐处理的qPCR技术，Me-qPCR技术可以节省了50%的检测时间，省去了繁琐的重亚硫酸盐转化步骤，免去了高昂重亚硫酸盐转化试剂盒费用，增加了甲基化检测的稳定性和准确性。Me-qPCR技术简便、易行、准确，将样本检测的稳定性、可重复性提高到新的高度；使用普通qPCR检测平台，还可实现甲基化检测的傻瓜式操作和流程自动化，为肿瘤甲基化标志物在临床转化落地及大规模应用奠定了坚实的技术基础。

在检测领域有两种分析类型：定性分析和定量分析。一般而言，多数肿瘤标志物的检测结果为定性分析，即阳性和阴性判断，在甲基化检测领域更是如此。受传统甲基化检测方法的限制，亚硫酸盐处理使检测的稳定性不足限制其对阈值的测算，只能给出定性结果。

基于Me-qPCR技术对DNA甲基化检测方法的创新，在全球甲基化检测领域，奕谱生物是第一个也是唯一一个对全癌标志物检测结果进行百分制赋值的生物公司。奕谱生物通过Me-qPCR技术检测样本中全癌标志物的甲基化水平，给出0~100的甲基化检测值。基于甲基化检测分值可将结果进行多层次的判读，如阴性、弱阳性、中阳性和强阳性等，按照检测结果所属的不同层次，可以给予医生更有针对性的临床建议，以及对不同肿瘤风险人群进行有效的分层管理。

更有价值的是，基于百分制的甲基化检测结果，可以做到肿瘤的伴随诊断，评估肿瘤药物治疗的效果，动态监测肿瘤复发等。在实体肿瘤治疗（免疫，靶向，化疗，放疗等）过程中，需要运用影像学手段定期（通常为三个月）检查，观察治疗手段对肿瘤的效果，为调整治疗方法提供科学依据。影像学检查一般只能发现0.5cm以上的病灶，且无法对病灶的性质进行判定。在免疫治疗过程中部分患者存在“假进展”或“超进展”，此时影像学无法对病灶及肿瘤进展进行准确的评估。由于影像学辐射及肿瘤进展的速度不一，影像学难以做到高频次的检查及肿瘤的动态监测。

目前，奕谱生物正与上海大型三甲医院开展利用全癌标志物进行免疫治疗疗效评估的临床研究。在超过3年的监测期内，奕谱生物不限癌种入组了一批进行免疫治疗的肿瘤患者，并使用患者不同时间点的血液样本进行全癌标志物甲基化检测，入组癌种涵盖肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌和尿路上皮癌等17种常见肿瘤，收集超过1000例的血液样本。通过对肿瘤患者不同时间点血液样本的甲基化检测，对患者的免疫治疗效果进行动态评估。

截至当前的数据分析，全癌标志物甲基化检测评估肿瘤进展变化较影像学要早3个月以上，奕谱生物的甲基化检测敏感性可达92.86%，特异性达83.33%。奕谱生物CEO化琳女士表示：“相较于影像学评估，全癌标志物甲基化能更早地预测免疫治疗的效果”。

甲基化判读百分制  奕谱生物供图

奕谱生物的全癌标志物有效填补了国内肿瘤甲基化标志物的空白，并在甲基化检测方法的性能上有了质的飞跃，肿瘤甲基化检测产品的开发也处于国际领先定位。目前，奕谱生物有两类领先的产品管线：女性生殖道肿瘤DNA甲基化分子检测产品与尿路上皮癌DNA甲基化分子检测产品。

● 女性生殖道肿瘤DNA甲基化分子检测

在女性生殖道肿瘤中主要有两类肿瘤：宫颈癌（宫颈鳞癌+宫颈腺癌）和子宫内膜癌。对于宫颈癌，常规筛查方式为HPV检测和液基细胞学（TCT）检查。

宫颈癌常规筛查方式 动脉网制图

对于子宫内膜癌，目前临床没有无创准确的筛查方式，常规检查流程是先进行超声和妇科检查，发现异常后进一步宫腔镜+病理活检明确诊断。超声通常无法发现早期子宫内膜癌病变；即使发现子宫内膜的异常，也无法对异常内膜的性质进行判定，子宫内膜癌的诊断还是需要有创的宫腔镜+活检。然而遗憾的是，宫腔镜+病理活检的假阳性率为34.5%，假阴性率达12.68%（总误差率高达47.2%）。而且，反复的刮宫会导致子宫内膜变薄，进而影响女性的生育功能。

由于临床常规的筛查手段都具有一定缺陷，一些分子诊断技术也成为女性生殖道肿瘤筛查的选择，但这些技术仍处于早期推广阶段，尚未大规模使用。

将肿瘤早筛提前至癌前病变阶段具有十分重要的意义，以宫颈癌为例，感染HPV病毒并不一定进展为肿瘤，或仅发展为低级别鳞状上皮内瘤变（LSIL），依靠人体自身免疫即可恢复；但是宫颈发生高级别鳞状上皮内瘤变（HSIL），其发展为宫颈癌就成为大概率事件。如果能将患者在宫颈LSIL向HSIL发展过程中筛查出来，即可通过锥切手术有效遏制宫颈癌变。

甲基化检测阶段 奕谱生物供图

奕谱生物与上海大型三甲妇产科医院为首的多家医院合作开展了全癌标志物甲基化筛查宫颈癌万人队列研究。最新的数据显示，全癌标志物甲基化检测对（≥HSIL）筛查的敏感性为90.7%，特异性为95.1%。临床中，女性子宫内膜癌较宫颈癌更加难以诊断，但是根据子宫的解剖结构，宫腔脱落的细胞都会在宫颈口富集，所以奕谱生物利用宫颈TCT样本也能有效检出子宫内膜癌，特异性和敏感性分别达到87.3%和90.9%。

基于全癌标志物检测，奕谱生物开发了产品宫奕安，筛查涵盖宫颈癌（包括宫颈鳞癌和宫颈腺癌）和子宫内膜癌。该产品的检测样本为宫颈脱落细胞，仅需一次取样即可同时筛查宫颈癌和子宫内膜癌，可有效地对生殖道肿瘤高危人群进行诊断及风险评估。全癌标志物甲基化检测对于女性生殖道肿瘤的筛查是颠覆性的创新和质的提升。

● 尿路上皮癌DNA甲基化分子检测

尿路上皮癌是泌尿系统第二大高发肿瘤，分为上尿路上皮癌（UTUC）包括肾盂癌和输尿管癌，下尿路上皮癌主要为膀胱癌。患者最常见的临床表现为血尿，大约80%~90%的尿路上皮癌患者以间歇性、无痛性、全程肉眼血尿为首发症状。

通过统计，90%的尿路上皮癌是膀胱癌，而膀胱癌占术后复发率高，临床医生建议患者术后每三个月进行一次膀胱镜，检查肿瘤是否复发。膀胱镜由尿道侵入观察膀胱情况，该检查痛苦、有创，易造成尿道、膀胱粘膜损伤，患者的依从性较差；且无法探查上尿路上皮癌（肾盂及输尿管等部位）情况，而且膀胱镜检查极度依赖临床医生个人经验。

奕谱生物开发的基于全癌标志物尿路上皮癌DNA甲基化分子检测产品滂奕清，是近期被FDA授予突破性医疗器械认证的全球首个尿路上皮癌DNA甲基化检测产品。奕谱生物与全国多家知名三甲医院合作开展的多中心临床队列研究结果显示，产品滂奕清检测尿路上皮癌的敏感性为85%，特异性达90.12%。除了尿路上皮癌早筛检测，全癌标志物甲基化指标还可在术后、膀胱灌注化疗后以评估手术和灌注化疗的治疗效果，并通过无创的尿液甲基化检测持续监测肿瘤的复发。此外，滂奕清具有取样限制少、尿液保存时间长等优点，可实现尿路上皮癌全流程数字化监测管理。

尿路上皮甲基化检测趋势图（注：蓝线为甲基化水平） 奕谱生物供图

“此次全癌标志物获FDA突破性医疗器械认定，是奕谱生物全癌标志物迈出国门的第一步，奕谱生物将持续推进产品商业化落地，希望将奕谱全癌标志物检测产品早日服务于院内及院外广大群众。”奕谱生物CEO化琳表示。

参考资料：

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【2】. Dong S, Li W, Wang L, Hu J, Song Y, Zhang B, et al. Histone-Related Genes Are Hypermethylated in Lung Cancer and Hypermethylated HIST1H4F Could Serve as a Pan-Cancer Biomarker. Cancer Res. 2019;79:6101-12.

【3】.Dong, S., et al., Hypermethylated PCDHGB7 as a universal cancer only marker and its application in early cervical cancer screening. Clin Transl Med, 2021.11(6): p. e457.

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