揭秘：MDSC为什么能在在肿瘤微环境中大量积累？(二)

2023-11-16 08:11

HIF-1通过EntPD2/CD39L1促进肝癌中MDSC的聚集

Hi，大家好，我是小Q

肿瘤进展过程中，MDSC在肿瘤组织中大量积累，这些MDSC是怎么来的呢？上一期，我们分享了2017年发表在Nature Communications上的一篇研究性文章，介绍了这篇文章的摘要和背景部分，相信大家对MDSC、HIF1α和ENTPD2有了基本的认识。本期，我们继续分享这篇文章的研究结果。

1.缺氧条件下EntPD2在肝癌组织中过表达并与肝癌进展正相关

三种肝癌细胞系MHCC97L、PLC/PRF/5和Hep3B，暴露于20% O₂（常氧）和1% O2（缺氧），进行实时定量PCR分析，结果发现，ENTPD和NT5E在缺氧的诱导下显著上调，其中ENTPD2上调幅度最大（图1a）。

检索TCGA数据库，比较了49对人肝癌组织及其配对的非肿瘤肝组织中ENTPD和NT5E的表达，发现ENTPD2在肝癌组织中显著上调（图1b）。

临床上，ENTPD2在肝癌患者中也过表达，提示ENTPD2可能在促进肿瘤发生中发挥作用（图1c）。

ENTPD2 mRNA在肝癌组织中的过度表达，在62例肝癌患者的扩大队列以及TCGA数据中得到了验证（图1d）。

更有趣的是，EntPD2与肿瘤微卫星形成和肝癌转移相关（图1e）。

在肝癌患者中，ENTPD2的高表达与较差的无病生存率和总生存率显著相关（图1f）。

免疫组织化学染色证实，相对于正常肝组织NT，人肝癌组织高表达ENTPD2蛋白（图1g）。

图1 缺氧条件下EntPD2在肝癌组织中过表达并与肝癌进展正相关

2.EntPD2的表达由转录因子HIF1α启动

取10例人肝癌组织切片，针对ENTPD2蛋白和两种缺氧标记蛋白（GLUT1和CA9）进行免疫组化染色，观察到ENTPD2与GLUT1、CA9共定位（图2a）。

肝癌细胞MHCC97L敲低HIF1α和HIF2α之后检测ENTPD2基因的表达，发现缺氧条件下，只有敲除HIF1α，ENTPD2基因的表达量才会降低（图2b）。

肝癌细胞MHCC97L敲除HIF1α之后，ENTPD2基因和蛋白的表达量都会显著降低（图2c）。

在ENTPD2的启动子区设计了三个含有HIF-1α结合共有序列5′-A/GCGTG-3′的假定缺氧反应元件（HRE）（图2d），染色质免疫沉淀（ChIP）分析表明，低氧条件下，HIF-1α和HIF-1β与这三个HRE直接结合（图2e）。

图 2 EntPD2的表达由转录因子HIF1α启动

3.ENTPD2促进HCC肿瘤生长和MDSC积聚

选取人源肝癌细胞MHCC97L和小鼠肝癌细胞Hepa1-6，敲低ENTPD2。体外实验中，ENTPD2对肝癌细胞的增殖没有影响（图3a）。

将MHCC97L细胞原位接种到BALB/C裸鼠中，发现ENTPD2的敲减显著减缓了肿瘤生长（图3b,c）。

由于BALB/C裸鼠缺乏T细胞，因此该模型可能不能完全反映MDSC的免疫抑制作用，因此将Hepa1-6细胞原位接种到具有免疫活性的C57BL/6小鼠中，发现ENTPD2极大地抑制了C57BL/6小鼠中的肿瘤生长（图3d）。

ENTPD2对体外和体内肿瘤生长的不同影响表明，ENTPD2可能通过塑造肿瘤微环境而不是直接影响肿瘤细胞本身来促进肿瘤生长。进一步分析肿瘤组织中各种免疫细胞的百分比，发现ENTPD2的敲低减少了肿瘤中MDSC的数量（CD11b+ GR+），但增加了CD4+和CD8+ T细胞群的数量（图3e）。

从肿瘤中分选CD11b+ Gr+细胞，与CFSE标记的CD4+ T细胞共培养，发现这群CD11b+ GR+细胞能够显著抑制CD4+ T细胞的增殖，表明这群CD11b+ GR+细胞具有免疫抑制活性，是MDSC（图3f）。

这些数据表明，ENTPD2能够促进肝癌肿瘤发生并向肿瘤组织中招募MDSC。

图3 ENTPD2促进HCC肿瘤生长和MDSC积聚

4.ENTPD2通过5′-AMP促进MDSC的积聚

利用CRISPR-dCas9系统在MHCC97L肝癌细胞中稳定过表达ENTPD2，收集MHCC97L细胞的上清，培养C57BL/6小鼠脾脏中新鲜分离的CD11b+Gr1+MDSC细胞，与空载对照相比，ENTPD2过表达的肝癌细胞能够维持更多的MDSC存活（图4a）。

由于ENTPD2的功能是将细胞外ATP去磷酸化为ADP，随后去磷酸化为5′-AMP，我们检测了ENTPD2对肝癌细胞中这些细胞外代谢物水平的影响。LC-MS分析显示，低氧增加了人MHCC97L和小鼠Hepa1-6肝癌细胞系胞外ATP水解速率和胞外5′-AMP的量，并且这些作用在ENTPD2敲低或通过两种ENTPD2抑制剂ARL67156和POM-1抑制ENTPD2时被消除。这些数据表明，癌细胞的ENTPD2促进了微环境中细胞外ATP向5′-AMP的转化（图4b,c）。

为了检测5′-AMP是否调节MDSC，我们在不同浓度的5′-AMP存在下培养CD11b+ Gr1+ MDSC。5′-AMP水平与4天后培养物中剩余的CD11b+ Gr1+ MDSC的量正相关（图4d）。

据报道，MDSC可能表达NT5E，其可进一步将细胞外5′-AMP去磷酸化为腺苷，NT5E的竞争性抑制剂APCP 不能消除5′-AMP对MDSC的维持，说明MDSC的维持与腺苷无关（图4e）。

此外，我们证明5′-AMP可以增加从骨髓祖细胞诱导的MDSC的量（图4f）。这表明在我们的实验模型中，5′-AMP是调节MDSC的关键细胞外代谢物。

图4 ENTPD2通过5′-AMP促进MDSC的积聚

5.ENTPD2和5′-AMP调节M-MDSC分化的命运

CD11b+Gr1+MDSC由CD11b+Ly6C+M-MDSC和CD11b+Ly6G+PMN-MDSC两个亚群组成。在培养过程中，M-MDSC倾向于分化为树突状细胞或巨噬细胞，而PMN-MDSC不能分化并容易发生凋亡。

从C57BL/6小鼠中分离两个MDSC亚群，分别检测它们对5′-AMP的反应。结果显示，5′-AMP不影响PMN-MDSC和总MDSC的存活（图5a）。

然而，在5′-AMP的存在下，获得成熟标记物F4/80和CD11c的M-MDSC更少（图5b, c），由于CD11b+Ly6c+F4/80+CD11c+细胞可被鉴定为单核细胞衍生的树突状细胞，所以表明5′-AMP阻止了M-MDSC的成熟。

MDSC可能表达NT5E，其可进一步将细胞外5′-AMP去磷酸化为腺苷，NT5E的竞争性抑制剂APCP不能逆转表型（图5d），这表明该作用主要与5′-AMP有关，而与腺苷无关。

图 5 ENTPD2和5′-AMP调节M-MDSC分化的命运

为了进一步支持这一论点，我们比较了5′-AMP、腺苷和非选择性腺苷受体激动剂5′-N-乙基甲酰氨基腺苷（NECA）对M-MDSC成熟的影响。腺苷没有作用，而NECA仅有轻微作用（图5e）。

接下来，为了研究ENTPD2是否可以在体内调节M-MDSC分化的命运，将CFSE标记的M-MDSC与Hepa1-6-EV或shENTPD2克隆皮下共接种到C57BL/6小鼠中（图5f）。分离肿瘤，对树突细胞表面标记进行染色，采用流式细胞术分析CSFE标记细胞的状态（图5g）。结果发现，敲低ENTPD2导致CFSE标记的CD11c+F4/80+群体增加（图5g），表明ENTPD2阻止M-MDSC和总MDSC分化为树突细胞。

与对照HCC细胞相比，M-MDSC与ENTPD2敲低的肝癌细胞的共接种也抑制肿瘤生长（图5h）。

6.ENTPD2抑制剂增加抗PD-1/CTLA-4的疗效

MDSC抑制T细胞，降低T细胞相关免疫疗法的效果。CTLA-4和PD-1是癌症免疫疗法中最热门和研究最广泛的免疫检查点受体。CTLA-4和PD-1是T细胞的抑制性受体。

T细胞的活化依赖于双信号，第一信号是T细胞的TCR和抗原提呈细胞的MHC II对抗原的识别；第二信号是T细胞的CD28和抗原提呈细胞的CD80/86介导的协同刺激信号。

CTLA4和CD28都是CD80/86的受体，并且相比于CD28，CTLA4对其配体的亲和力更强。CTLA-4通过与CD28竞争其配体CD80/CD86来阻止T细胞的活化。CTLA4也能够通过反式内吞作用消耗APC上的CD80/CD86，来间接地抑制CD28信号。

T细胞表面的PD-1与抗原提呈细胞表面的PD-L1结合之后，诱导PD-1的酪氨酸磷酸化，招募SHP2，SHP2是一个磷酸酶，能够去磷酸化TCR和CD28，从而抑制T细胞活化的第一信号和第二信号。

抗CTLA-4抗体（Ipilimumab）和抗PD-1抗体（Nivolumab）首次被美国食品和药物管理局批准用于治疗黑色素瘤，并在癌症患者中具有显著的长期生存效益，而它们在肝癌患者中的效率和疗效仍不清楚。

我们假设：阻断癌细胞中的ENTPD2能够抑制MDSC，增加T细胞向肿瘤中浸润，从而提高免疫检查点疗法在癌症治疗中的有效性。

结果显示，ENTPD2抑制剂ARL67156和POM-1的单一治疗显著降低了C57BL/6小鼠中Hepa1-6移植瘤的生长（图6a）。值得注意的是，与ARL67156相比，POM-1对肝癌的抑制作用略强，因为POM-1可同时抑制ENTPD1和ENTPD2。

既往研究证明，在小鼠黑色素瘤模型中，抗CTLA-4和抗PD-1抗体的联合在激活肿瘤内的T细胞方面比单一抗体治疗更有效。在小鼠Hepa1-6肝癌移植瘤模型中，免疫检查点抑制剂（抗CTLA-4和抗PD-1）的联合比POM-1有效，POM-1和两种免疫检查点抑制剂（COM）的组合实现了最高的肿瘤抑制反应（图6b）。

通过POM-1或免疫检查点抑制剂治疗，肿瘤组织中的MDSC显著减少（图6c）。在更长的时间点收集肿瘤，我们发现治疗能够实现肿瘤消退，POM-1和免疫检查点抑制剂（抗CTLA-4和抗PD-1）的联合在更大程度上促进肿瘤消退，显著增加了淋巴细胞的浸润（白色箭头）并且减少了肿瘤细胞（黑色箭头）（图6d）。

为了研究免疫检查点抑制剂的长期作用，我们使用亚硝基二乙胺（DEN）和四氯化碳（CCl4）化学诱导小鼠肝癌模型。在该模型中，我们进一步证明联合治疗可以使携带肝癌的小鼠的存活率最大化（图6e）。

图 6 ENTPD2抑制剂增加抗PD-1/CTLA-4的疗效

总之，这项研究表明，抑制ENTPD2是提高PD-1/CTLA-4免疫检查点抑制剂在癌症治疗中的疗效的一种很有前途的策略。

本期内容就这么多了，下期我们分享这篇文章的讨论和结论部分，关注小Q，我们下期再见~

参考文献

[1] D.K.-C. Chiu, A.P.-W. Tse, I.M.-J. Xu, J. Di Cui, R.K.-H. Lai, L.L. Li, H.-Y. Koh, F.H.-C. Tsang, L.L. Wei, C.-M. Wong, I.O.-L. Ng, C.C.-L. Wong, Hypoxia inducible factor HIF-1 promotes myeloid-derived suppressor cells accumulation through ENTPD2/CD39L1 in hepatocellular carcinoma, Nature Communications 8(1) (2017).

END

撰文丨小Q

排版丨阿洛

揭秘：MDSC为什么能在在肿瘤微环境中大量积累？

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来源: qq

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