5+文章复现 | 不止TCGA和GEO，外部数据库也能验证临床预测模型

标题：Identification of necroptosis-related genes as prognostic indicators for lower-grade glioma

（鉴定坏死性凋亡相关基因作为低级别胶质瘤的预后指标）

期刊：American Journal of Cancer Research

IF：5.942（2022年）

全文共10图

文章概要

套路： 肿瘤（低级别胶质瘤）

数据来源：TCGA-LGG RNA-seq FPKM格式数据

技术路线：通过TCGA数据库下载LGG的RNA-seq FPKM格式数据和临床数据→对差异基因进行互作分析，制作PPI网络图和相关性热图→对差异基因进行单/多因素Cox回归，制作森林图，利用风险评分筛选分子→对筛选出来的分子进行Lasso系数筛选，制作变量轨迹，利用风险评分再筛选一遍分子→对风险相关基因进行风险评估、生存分析和预后表现分析→对风险评分和临床特征做综合Cox分析→通过风险评估模型对LGG进行预后分析，制作列线图和校准曲线→对风险相关基因进行GOKEGG富集分析→对高/低风险组进行基因突变→对风险相关基因进行免疫浸润分组分析，制作免疫浸润相关性散点图

图表简介

Figure 1 | 差异基因的表达差异和互作关系

Figure 2 | 差异基因的单因素Cox回归分析和预后分析

Figure 3 | 差异基因的KM生存曲线

Figure 4 | 差异基因的风险评估、生存分析和预后表现

Figure 5 | 风险评分和临床特征的HR值的单/多因素分析

Figure 6 | LGG的预后列线图和预后校准曲线

Figure 7 | 风险相关差异基因的GOKEGG富集分析

Figure 8 | 高/低风险组的基因突变情况

Figure 9 | 风险评分的免疫特征

Figure 10 | 差异基因的免疫浸润分析

分析工具

仙桃学术（https://www.xiantaozi.com/）（新版）

各种生信分析工具

STRING（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和Cytoscape软件

制作PPI网络图

cBioPortal数据库（https://www.cbioportal.org/）

基因的突变情况

TIMER数据库（http://timer.cistrome.org/）

免疫浸润相关性分析

复现流程

Figure 1A | 差异基因的差异表达小提琴图

Figure 1B | 差异基因的PPI网络

Figure 1C | 差异基因的相关性热图

Figure 1A复现

进入仙桃网站（https://www.xiantaozi.com/），选择【生信工具】，在左侧的【表达差异】中选择我们需要用到的【[云]疾病vs非疾病】。

云端数据选择低级别胶质瘤TCGA_GTEx的FPKM格式数据。

【特殊参数】中输入差异基因，这里以Figure 1A第一行的基因为例。

【主要参数】中选择展示小提琴，点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 1B复现

在STRING数据库（https://cn.string-db.org/）网站中选择Multiple proteins，输入所有的差异基因，物种选择人类，然后点击【SEARCH】。

点击【CONTINUE】。

点击【Exports】，下载第四个.tsv格式的数据。

打开Cytoscape软件，选择Network file to load，上传刚才下载的数据，点击【OK】。

点击左侧的【Style】可以选择更改样式。

点击Fill Colour的第二个框框。

【Column】选项选择degree layer，【Mapping Type】选择Continuous Mapping。

双击色谱，调整好颜色渐变后点击【OK】。

调整好样式之后选择【Export as Image】保存为.pdf或其他格式。

Figure 1C复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【交互网络】中选择我们需要用到的【[云]相关性热图】。

云端数据选择低级别胶质瘤TCGA的FPKM格式数据，【主要参数】中输入所有差异基因，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 2A-B | 差异基因的Cox回归森林图

Figure 2C | 差异基因的预后LASSO系数筛选

Figure 2D | 差异基因的预后LASSO变量轨迹

Figure 2A复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【[云]Cox-分子】。

云端数据选择低级别胶质瘤TCGA的FPKM格式数据。【主要参数】中输入21个差异基因，然后点击【确认】。

下载Cox回归结果和Riskscore风险评分。

打开Cox筛选的Riskscore结果，记录列头展示的风险相关基因。

打开Cox回归结果，只保留基因名和单因素的HR值和p值共3列（注意保存原始结果文件）。

只保留刚才记录的风险相关基因，按下图整理数据，另存为文件【Cox筛选基因森林图】

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【森林图】。

上传森林图文件，点击【验证】，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 2D复现

Figure 2B-C都是在Figure 2D的筛选基础上得到的结果，故先复现Figure 2D

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【[云]预后Lasso系数筛选】。

云端数据选择低级别胶质瘤TCGA的FPKM格式数据。【主要参数】中输入Cox筛选过后的15个风险相关基因，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

点击保存Lasso-Riskscore，点击【保存结果】并命名。

Figure 2B复现

打开Lasso筛选的Riskscore结果，记录列头展示的风险相关基因。

对这些基因做Cox回归分析，过程同复现Figure 2A，只需要将输入的基因换成这些风险相关基因即可。

Figure 2C复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【[记录]预后Lasso变量轨迹】。

默认上传前一次的Lasso筛选结果，点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 3A-J | 不同差异基因在LGG中的KM生存曲线(OS)

Figure 3A复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【[云]生存曲线（KM图）】。

云端数据选择低级别胶质瘤TCGA的FPKM格式数据，【特殊参数】中分别输入差异基因。这里以复现Figure 3A为例，输入FADD，Figure 3B-J需要在这里修改相应的差异基因。

【主要参数】中选择时间单位为月，点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 4A-B | TCGA和CGGA数据的风险因子图

Figure 4C-D | TCGA和CGGA数据库的KM生存曲线

Figure 4E-F | TCGA和CGGA数据库的时间依赖ROC

Figure 4A复现

新建一个excel文件并命名为【TCGA-风险因子图】，将Lasso筛选后的Riskscore文件中除了第一列样本id之外都复制过去（0=Alive；1=Dead）。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【风险因子图】。

上传风险因子文件，点击【验证】，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 4C复现

Figure 4ACE为对TCGA数据库的分析，故放到一起复现，Figure 4BDF为对CGGA数据库的分析

新建一个excel文件并命名为【TCGA-KM】，将Lasso筛选后的Riskscore文件中的event、time和riskscore列复制过去。

将time列的数据换算成月，可以用ROUND函数“=ROUND(数值/30,0)”。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【生存曲线（KM）图】。

上传KM曲线的文件，点击【验证】。

【主要参数】中选择展示置信区间和风险表格，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 4E复现

数据处理和Figure 4C的KM曲线一致，不要把时间单位换算成月，保存文件为【TCGA-时间依赖ROC】。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【时间依赖ROC】。

上传时间依赖ROC文件，点击【验证】。

【主要参数】中预测时间输入1年、3年和5年，点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 4BDF复现

新建一个excel文件并命名为【CGGA-Lasso筛选】，打开CGGA的原始表达矩阵和临床信息，将Cox筛选之后的风险基因的表达、生存情况和存活时间信息复制过去，保存文件。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【预后Lasso系数筛选】。

上传CGGA的Lasso筛选文件，点击【验证】，点击【确认】。

点击下载CGGA的Lasso-Riskscore文件。

有了CGGA数据库样本的风险评分，再按照复现Figure 4ACE的复现方式，分别复现风险因子图、KM曲线和时间依赖ROC即可。

Figure 5A-B | 预后单/多因素Cox回归森林图

Figure 5C | 预后基因风险评分与临床因素的关系

Figure 5D-F | 临床因素的ROC分析以预测TCGA-LGG患者的预后。

Figure 5A-B复现

新建一个excel文件并命名为【riskscore临床变量Cox】，将Lasso筛选后的Riskscore文件中生存情况、存活时间和Riskscore复制过去，再打开TCGA的样本信息文件，将各样本的Age、Gender、Grade和Radiation信息复制过去。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【单因素多因素Cox】。

上传Cox文件，点击【验证】，然后点击【确认】。

下载风险因子和临床变量的Cox回归结果和风险因子和临床变量的Riskscore。

新建两个excel文件分别命名为【riskscore临床变量单因素森林图】和【riskscore临床变量多因素森林图】，分别将

风险因子和临床变量的Cox回归结果的单因素和多因素部分复制到相应文件中，并按下图整理数据。

按照复现Figure 2A的方式复制以上两个森林图。

Figure 5C复现

新建一个excel文件并命名为【Age-riskscore-箱线图】，打开【riskscore临床变量Cox】文件，将Age和Risk_score两列复制过去。

将Age列的数据整理成≤50和>50的两组并保存文件。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【基础绘图】中选择我们需要用到的【分组比较图】。

上传分组文件，点击【验证】。

【主要参数】中选择显著性显示类型为p值科学计数法，选择展示点和箱，修改样式，点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

新建一个excel文件并命名为【Age-riskscore-叠加柱状图】，分别统计【Age-riskscore-箱线图】文件中不同年龄分组和高低风险的样本数量，并按照下图方式绘制表格。

在左侧的【基础绘图】中选择我们需要用到的【叠加柱状图[宽型数据]】。

上传列联表，点击【验证】，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 5D复现

在【riskscore临床变量Cox】文件后加一列RiskScore+clinical，将风险因子临床变量Riskscore文件（复现Figure 5A-B时最后下载的Riskscore文件）的最后一列Riskscore数据复制到【riskscore临床变量Cox】文件的RiskScore+clinical列下。将所有的非数据数据转化为数据数据，例如Gender当中FEMALE=0，MALE=1；Grade当中G2=2，G3=3；Radiation_therapy中NO=0，YES=1。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【时间依赖ROC】。

上传时间依赖ROC文件，点击【验证】。

Figure 5D-F分别对应【主要参数】中预测时间1年、3年和5年，这里以Figure 5D的1年为例，输入时间1年，点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 6A | LGG多因素Cox回归的1/3/5年预后列线图

Figure 6B-D | LGG预后列线图的预后校准曲线

Figure 6A复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【预后列线图】。

上传Cox文件（即复现Figure 5A时上传的文件），点击【验证】，【主要参数】中选择预测时间1、3、5年，点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

点击【保存结果】并命名。

Figure 6B复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【[记录]预后校准曲线】。

默认上传之前保存过的列线图结果，【主要参数】中预测时间分别输入1、3、5年，这里以复现Figure 6B为例，输入预测时间1年，复现Figure 6C-D只需要修改预测时间为3年和5年即可，点击【确认】。

点击上方【历史记录】，点击下载预后校准曲线图。

Figure 7A | 风险相关差异基因的表达热图

Figure 7B | 风险相关差异基因的GO圈图

Figure 7C | 风险相关差异基因的KEGG气泡图

Figure 7A复现

新建一个excel文件并命名为【风险相关DEGs表达热图】，在TCGA-LGG的FPKM原始表达矩阵中，将所有样本的风险相关差异基因的表达量和其样本id复制过去，再根据Lasso筛选之后所得的风险评分中位数将所有样本划为高风险和低风险，并另存为.csv格式。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【表达差异】中选择我们需要用到的【[记录]预后校准曲线】。

上传表达热图数据，点击【验证】，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 7B复现

对TCGA-LGG的Counts表达谱做去重、去除正常样本处理，另存为.csv文件【Counts风险差异分析】。

新建一个excel文件并命名为【Counts风险差异分析】，按下图将所有样本按风险评分中位数分为高风险组和低风险组，保存文件。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【表达差异】中选择我们需要用到的【转录组-Counts数据差异分析】。

上传Counts表达谱和分组情况，点击【验证】。

【主要参数】中选择低风险组为参考组，点击【确认】。

在【历史记录】中下载差异分析结果。

新建一个excel文件并命名为【GOKEGG联合LogFC】，将Counts差异分析结果中差异基因的id和LogFC复制过来，并保存文件。

在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GOKEGG联合FC]分析】。

上传GOKEGG联合LogFC文件，点击【验证】，【主要参数】中富集条目选择全部GO，点击【确认】。

点击下载富集分析结果，再点击【保存结果】并命名。

在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GOKEGG联合FC]圈图】。

默认上传前一次的GOKEGG联合LogFC富集分析结果，【主要参数】中多输入一些需要可视化的类目id（可以在刚才下载的富集分析结果中查看），点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

打开富集结果文件，ID列和discription列即为Figure 7B的类目表格。

Figure 7C复现

新建一个excel文件并命名为【GOKEGG】，将风险相关差异基因输入文件中，列头为id。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GOKEGG]分析】。

上传GOKEGG文件，点击【验证】，【主要参数】中的富集参数选择KEGG条目，然后点击【确认】。

按照复现Figure 7B同样的方式保存文件结果并命名。

在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GOKEGG]气泡图】。

默认上传前一次的GOKEGG富集分析结果，【主要参数】中选择颜色映射p值，点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 8A | 高风险组的基因突变情况

Figure 8B | 低风险组的基因突变情况

Figure 8A复现

打开cBioPortal网站（https://www.cbioportal.org/），点击左侧【CNC/Brain】，再点击TCGA的LGG数据集，再点击【Query By Gene】。

在选择样本集时，选择自定义样本集【User-defined Case List】。

打开Lasso筛选后的Riskscore文件，删除正常样本，取各样本id的前12位，以Riskscore的中位数筛选高/低风险的样本。这里以Figure 8A为例，筛选高风险样本，复现Figure 8B则需要筛选低风险样本。

选择【By patient ID】，将筛选出的高风险样本id前12位复制到列表中，下方输入突变相关基因，点击【Submit Query】

点击【View】，取消展示空白和空隙。

点击【Tracks】，只选择展示突变谱和TMB（肿瘤突变负荷）。

点击【Download】，选择下载为合适的格式。

Figure 9A-C | 高低风险组estimate算法下的箱线图

Figure 9D | 高低风险组Cibersort算法下的箱线图

Figure 9E | 高低风险组ssGSEA算法下的箱线图

Figure 9A-C复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【交互网络】中选择我们需要用到的【[免疫浸润-云]棒棒糖图】。

云端数据选择低级别胶质瘤TCGA的FPKM格式数据，【特殊参数】中任意输入分子，【主要参数】中算法选择estimate，然后点击【确认】。

点击下载分析数据。

删去基因列，只保留StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore列，并根据Lasso筛选后的风险评分中位数将所有样本分为高低风险组，重命名文件为【estimate】。

在左侧的【基础绘图】中选择我们需要用到的【分组比较图】。

上传estimate文件，点击【验证】。

【主要参数】中选择显著性类型为p=科学计数，选择不展示点，展示箱式图，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Figure 9E复现

复现流程和Figure 9A-C一致，只需要一开始选择棒棒糖图获取数据时，将算法修改为ssgsea，得到数据后以同样的方式将样本分组并进行可视化。

Figure 10A-J | 差异基因的免疫浸润分析

Figure 10A复现

打开TIMER网站（http://timer.cistrome.org/），点击【Immune Association】。

选择基因和免疫细胞，这里以Figure 10A的第2张图为例，选择SIRT1和B cell，点击【Submit】。

点击LGG行的TIMER列数据，选择下载为合适的格式。

Figure 10A的其余的图以及Figure 10B-J只需要修改免疫细胞和基因即可。