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【虎年吉祥】请教牛人们克隆问题！

【虎年吉祥】请教牛人们克隆问题！# Biology - 生物学

m*j2010-02-15 08:02

1 楼

美国的博士后在发达国家里算是pay的最少的了吧,最近看广告,发现澳洲,欧洲的很多博
后价码比美国高,加拿大pay的比美国稍微高一些,考虑到美国的税非常高,而且奥巴马继
续做总统的话这research又得冷四年, 以后faculty基本上大部分人都指望不了,这说明
美国博后是越来越没做头了吧.

H*72010-02-15 08:02

2 楼

日本人（？）咬着别扭的国语装B。兄弟俩还有这么大口音不同？就不会找个配音的？
其他对战国生活的
常识性错识也不少，说是清朝还差不多。
一惯的说教性电影，家啊，国啊，和平啊，给不给国家丢脸啊。再硬塞个女的进来。

d*a2010-02-15 08:02

3 楼

学过历史之后，发现，圆明园不但是清廷的痛；而且是很多后来的中国人的余痛。
有那么多人痛恨清廷，有那么多人痛恨清廷的统治者。清朝时期，西方列强对中国
的入侵，最严重的受害者，应该就是清廷，因为，江山社稷都是他们的。基于对清廷及
其统治者的痛恨，按说，那些排满的人士、那些反封建的人士，他们直面西方列强对清
廷的破坏时，应该高兴才是。但事实是，他们并没有高兴。不但他们高兴不起来，就连
他们之后，进入新体制、进入新时代对清廷仇视的大多数人，在面对那一段被侵略的历
史时，都还时时有隐痛郁积在胸中，久久无法释怀。
为什么会这么复杂，这么矛盾呢？
其实，这一切，正好说明了以下道理：
从小历史来看，无论大家对清朝怀了怎样的态度，对清朝的形形色色的人物怀了怎
样的情感，都无法否认清朝就是中国历史的一部分，也无法割裂清朝在中国历史中的衔
接作用。
从大历史来看，无论是怎样的统治，在历史的长河中，它都只是或长或短的一节，
贬斥，减少不了它存在的年限；粉饰，也增加不了它生命的厚度。
从情感的角度来说，在历史的长河中，政权都是在不断更迭的。我们爱自己的国家
，爱的不是任何特定的统治。我们爱自己的国家，爱的是这块土地上绵延不绝的文化，
爱的是这个民族生生不息的精神。
这里，来说一说清朝时期，关于圆明园的事情。
本文出自清人陈康祺的笔记《郎潜纪闻初笔》中的《沈侍御谏罢重修圆明园》一节。
圆明园的旧址，原本是明朝皇亲国戚徐伟（生平不详）的别墅。
到了清圣祖康熙朝，这里的名字还是畅春园。
清世宗雍正没有继位登基之前，康熙帝下令，在畅春园中开辟土地、建筑室屋，作
为雍正读书的处所。一切办妥之后，康熙帝亲自赐名，命此园为“圆明”。
这就是圆明园的简要由来。
从雍正帝之后，就不再有畅春园这一称呼了。
圆明园距离平则门二十华里。
平则门，也就是后来的阜成门。
阜成门位于京师西城区中部，元代时，这里是大都城平则门的所在地；到了明、清
两代，这里是京师内城的九门之一。由于这里是明、清两代自门头沟运煤进城的重要通
道，所以，这个门还有“煤门”的称呼。二十世纪五十年代以后，阜成门及内城的城墙
不断被拆除，最终因建设施工，阜成门等老城就荡然无存了。
清朝的皇帝，避暑或者外出巡幸，每一年之中，都会圆明园之中停驻，所有时间累
加起来有好几个月。这在清朝是很常见的事。
清文宗咸丰庚申（咸丰十年，公元1860年，农历庚申），西方的英、法两国，组成
侵华联军，大举入侵，从天津大沽口进攻，逼至北京。咸丰帝仓皇出逃，京师的亭台苑
囿，被联军荼毒破坏，大好的皇家园林，在兵火之中，化作了灰烬。
咸丰帝仓皇出逃的第二年，他在热河驾崩。
清朝二百一十八年的基业，京师不能驻守；万人之上的皇帝，出逃到热河之后，死
在了外面。不知道，这是一种悲哀，还是一个讽刺？
想一想，咸丰帝要是知道几代祖先的基业、几代经营的皇家园林已经被西方军队破
坏、焚烧，他的心，应该会深深地伤痛吧！
清穆宗同治即位时年仅六岁，国家大政基本上都是由两宫（孝贞慈安皇太后、孝钦
慈禧皇太后）操持。这一时期，也曾有满洲的御史上疏，建议修复被西方军队破坏的圆
明园。但是，两宫并没有采纳这位御史的奏折，而且，在接到这位御史的上疏之后，清
廷还下旨，严厉地对这一建议进行了斥责。
到了同治十一年（公元1872年），同治帝时年十七岁。本年农历九月十五，同治帝
大婚。
大婚，意味着成人。
成人，意味着就可以亲政。
这一年，广东有一个人，名叫李光照。这个人，很有头脑，他对荣华富贵有自己的
想法和计划。瞅中机会之后，李光照向内务府呈请，说是自己可以无偿提供花草树木，
作为个人捐献，用作重修淀园（圆明园）之用。
话说，同治帝很是孝顺，对重修圆明园的想法非常感动。
也有人说，同治帝心中，其实有他自己的小算盘，重修圆明园，就是要摆脱两宫的
束缚，想把两宫皇太后移走。
同治帝同意重修圆明园的对外说辞是：
他自己常常想着，两宫皇太后听政理国，非常辛苦。但是，京师虽大，现在却没有
什么可以让两位皇太后悠游、娱乐、休闲、歇息的地方。所以，他就答应了李光照向内
务府提出的呈请，许可重修圆明园。
这样的说辞，看起来当然很孝顺。
没有毛病！
李光照的实际情况怎么样呢？其实，他就是一个穷人家里的子弟。虽然家贫，但是
，李光照很懂得钻营，所以，他有主政者宠信的身边人作为护身符。然后，李光照借着
自己所依傍的后台人物，游历了川、楚、江、浙等主要的木材产区。游历之中，李光照
拉大旗做幌子，说自己是受了某某部门的差遣、说自己与某某人关系亲密，还说自己要
为重修圆明园筹集花草树木。然后，他到处勒索，骗财骗物，中饱私囊，大大地赚了好
多银子。
李光照的行为，最后还是被朝廷察觉。他的奸谋诡计被识破之后，最终被按照律令
进行了惩处。这样一来，也使得民间少了一些借虎皮进行为非作歹骚扰。
当时，提议重修复兴圆明园的事情之后，朝廷内外，都有些错愕。
虽然惊愕，但是，敢于直言进谏，触犯天听的人，还是寥寥无几。
都察院开始也没有声音。
很快，都察院的御史沈桐甫（淮）率先上书力争，以为重修圆明园一事不可行。
同治帝对沈桐甫的上书力争异常愤怒，并立刻安排召见他。
召见中，同治帝对沈桐甫讲了大孝养志的内涵。
关于大孝养志，顺便简单看看古人是怎么说的：
汉代桓宽《盐铁论·孝养》：
“故上孝养志，其次养色，其次养体。”
宋代苏轼《赐正议大夫同知枢密院安焘乞外郡不许批答》之一：
“夫荣亲莫大於功名，养志不专於甘旨。”
清代陈梦雷《抒哀赋》：
“体养志以娱亲兮，驾言返於故闾。”
同治帝讲完大孝养志的一席话之后，沈桐甫一时还难以应对。
写文章、写奏折是一回事，应变、应答是另外一回事。
沈桐甫平常就不善言辞，等同治帝讲完大道理之后，他半天都说不出话来。
缓了缓神，面对皇帝盛怒之下的场面，沈桐甫十分胆怯、小心谨慎地回答到：
“重修圆明园一事，在孝道上来说，是无可非议的。但是，这个时候重修，时机不
对；重修过程中，可能还会靡费甚多；如果真是这样，肯定会对皇上的圣德有所挂累。”
沈桐甫退朝之后，就来拜访过笔记作者陈康祺。
陈康祺就沈桐甫上书力争重修圆明园一事，说了自己的看法：
“皇上是圣明的！年丈最好再补写一份奏折。奏折的语气尽量平缓一些，把重修圆
明园的利害讲清楚。这样，或许可以改变皇上的心意。”
“您可以这样着笔：天子是要用整个天下来供养的，但凡可以博得皇太后欢心的事
，都是大孝。这样的事情，怎么可能需要去顾惜钱财呢？但是，圆明园被毁坏，并不是
因为天灾，而是兵祸。现今的天下，时事非常艰难，国家的仇敌还没有离开皇上的土地
，这个时候，这种状况，即便是国库充盈，也不应该突然就动议重修圆明园之事。更何
况，国家财力并不宽裕。”
“重修圆明园，皇上的起心动念，原本就是为了两宫皇太后能够颐养天年。但是，
臣下担心的是，圆明园重新修成之后，两宫皇太后入住其中，睹物思人，想起先帝出狩
热河，京师被外国军队荼毒，皇家园林付之一炬，先帝驾崩在外，反倒会心中伤痛，愀
然不乐！”
“既然皇上有重修圆明园的念头，皇上有孝亲的情怀，那么，皇上更应该自强不息
，时时刻刻以继承先祖、先皇的遗志、以治理好国政为信念。这样，才可以仰慰文宗皇
帝（咸丰）的在天之灵、才可以宽慰两宫皇太后的厚望之心。这样的话，对于孝道的发
扬广大，才是最有意义的。”
“如果按照这个思路来写奏折，皇上一定会有所感悟！”
沈桐甫对于笔记作者陈康祺的建议，他认为非常有道理，也非常得体；他还打算，
第二天就起草修订上书的折子，第三天就正式上书。
随后，就有侍御游百川袖存奏折，在朝会的时候，当廷谏诤。
朝堂之上游百川直言争辩，一口气讲了数百字，声音响亮、语气轩昂，其气势似乎
都可以把大殿上的瓦片震落。
当时，咸丰帝并没有马上就收回成命。
对于游百川的憨厚刚直，敢于直接冒犯龙颜，咸丰帝也没有当廷谴责。
结果，重修圆明园一事，最终还是作罢。
笔记作者陈康祺感叹道：
这般明君贤臣的事情，真可谓是大清的盛景啊！

q*d2010-02-15 08:02

4 楼

Plasmid pYD1-CipA1(3)-EGII was obtained by cotransforming G10A1-HR1, G10A1-
HR2,G10A1-HR3, G10A1-HR4, HisG-EGII, and DrdI/NheI-digested pYD1-
CipA1(3) into EBY100. All plasmids were purified from S. cerevisiae and
thentransformed into DH5a, recovered, and confirmed by DNA sequencing.
以上是我在一篇文章里找到的句子，有两个问题不明白，特来请教：
1.这是不是一种多片段克隆的方法，他是把vector和n个要插入的片段纯化之后不用连
接酶直接转化大肠，这种方法成功率如何？多少个片段都可以吗？
2.他的质粒纯化怎么用酵母呢，有什么优点吗？
谢谢大家，因为我有一堆克隆要做，急需要多片段克隆的方法，一个载体有14个片段要
插入！

a*n2010-02-15 08:02

5 楼

美国的税应该说是比较低的，而且物价在发达国家里头基本上是最低的，所以postdoc
工资和其他国家比不算低。
据说澳洲工资 = 美国工资*1.8

【在 m**j 的大作中提到】

: 美国的博士后在发达国家里算是pay的最少的了吧,最近看广告,发现澳洲,欧洲的很多博
: 后价码比美国高,加拿大pay的比美国稍微高一些,考虑到美国的税非常高,而且奥巴马继
: 续做总统的话这research又得冷四年, 以后faculty基本上大部分人都指望不了,这说明
: 美国博后是越来越没做头了吧.

b*d2010-02-15 08:02

6 楼

是个棒子，长得挺像小沈阳的~~~
不塞个女的，还要另外帮大哥叫ji

【在 H******7 的大作中提到】

: 日本人（？）咬着别扭的国语装B。兄弟俩还有这么大口音不同？就不会找个配音的？
: 其他对战国生活的
: 常识性错识也不少，说是清朝还差不多。
: 一惯的说教性电影，家啊，国啊，和平啊，给不给国家丢脸啊。再硬塞个女的进来。

h*r2010-02-15 08:02

7 楼

酵母自己有这样的重组系统，只要片段之间有足够的overlap就可以了。这个叫cloning
by homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae
可以看看这个paper，DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid
construction of biochemical pathways
P.S
You need a specific strain and plasmid. Go to
http://www.fgsc.net/gpkit.html
and order FGSC 9721 and pRS426.
(FGSC菌株最便宜)
You can follow the knockout protocol to create a long piece of DNA in yeast
through homologous recombination.
http://www.dartmouth.edu/~neurosporagenome/knockout_cassettes.

m*j2010-02-15 08:02

8 楼

我发现我博后工资25%要交税,房租占了工资的1/3,剩下来那点钱根本干不了啥事,加拿
大的税是不是只有10%?

postdoc

【在 a****n 的大作中提到】

: 美国的税应该说是比较低的，而且物价在发达国家里头基本上是最低的，所以postdoc
: 工资和其他国家比不算低。
: 据说澳洲工资 = 美国工资*1.8

q*82010-02-15 08:02

9 楼

hahaha
中间许三多和成龙被抓那段笑死我了

【在 b****d 的大作中提到】

: 是个棒子，长得挺像小沈阳的~~~
: 不塞个女的，还要另外帮大哥叫ji

q*d2010-02-15 08:02

10 楼

太感谢了，这个方法是实在太方便了

a*n2010-02-15 08:02

11 楼

加拿大的税10%？？？
同学，你在加拿大能拿到50%税前工资就不错了，当然加拿大是全民医保。

【在 m**j 的大作中提到】

: 我发现我博后工资25%要交税,房租占了工资的1/3,剩下来那点钱根本干不了啥事,加拿
: 大的税是不是只有10%?
:
: postdoc

m*d2010-02-15 08:02

12 楼

那个女的不怎么样吧
还不如酋长老婆

【在 b****d 的大作中提到】

: 是个棒子，长得挺像小沈阳的~~~
: 不塞个女的，还要另外帮大哥叫ji

b*n2010-02-15 08:02

13 楼

50%夸张了，2/3问题不大吧

【在 a****n 的大作中提到】

: 加拿大的税10%？？？
: 同学，你在加拿大能拿到50%税前工资就不错了，当然加拿大是全民医保。

s*y2010-02-15 08:02

14 楼

那帮野蛮人，包括酋长的老婆，都是成龙的徒弟，新七小福

【在 m*****d 的大作中提到】

: 那个女的不怎么样吧
: 还不如酋长老婆

e*r2010-02-15 08:02

15 楼

德国，法国是拿到手２０００欧左右，英国２０００英磅。懊洲多点，但是生活费
会高很多。只有瑞士钱真的比美国多

【在 m**j 的大作中提到】

H*r2010-02-15 08:02

16 楼

看最后演员表
那帮人除了女的以外基本全找的蒙古族演员啊

【在 s*y 的大作中提到】

: 那帮野蛮人，包括酋长的老婆，都是成龙的徒弟，新七小福

m*j2010-02-15 08:02

17 楼

没想到一年4万多竟然是全球最高,看来做博后真是白菜价.

【在 e*****r 的大作中提到】

: 德国，法国是拿到手２０００欧左右，英国２０００英磅。懊洲多点，但是生活费
: 会高很多。只有瑞士钱真的比美国多

J*i2010-02-15 08:02

18 楼

酋长老婆最后被弩箭射中的部位实在是太没人性了...

【在 m*****d 的大作中提到】

: 那个女的不怎么样吧
: 还不如酋长老婆

e*r2010-02-15 08:02

19 楼

我认识的去瑞士做POSTDOC，一般是折合６－７万美元

【在 m**j 的大作中提到】

: 没想到一年4万多竟然是全球最高,看来做博后真是白菜价.

b*i2010-02-15 08:02

20 楼

成龙就是一烂片之王

【在 J*******i 的大作中提到】

: 酋长老婆最后被弩箭射中的部位实在是太没人性了...

c*r2010-02-15 08:02

21 楼

扯，澳洲8-9万澳元很正常
瑞士一定比美国高

【在 m**j 的大作中提到】

: 没想到一年4万多竟然是全球最高,看来做博后真是白菜价.

e*h2010-02-15 08:02

22 楼

同意.

s*e2010-02-15 08:02

23 楼

美国的税非常高？您没查过西欧特别是北欧的税制吧……

【在 m**j 的大作中提到】

v32010-02-15 08:02

24 楼

基本上又一部国产烂片。

【在 H******7 的大作中提到】

m*j2010-02-15 08:02

25 楼

我周围很多博后都考虑回国了,虽然他们在美国拿着全球最高的pay,真是奇怪

【在 s***e 的大作中提到】

: 美国的税非常高？您没查过西欧特别是北欧的税制吧……

s*e2010-02-15 08:02

26 楼

你哪只眼睛看见说美国的POSTDOC全球最高了？

【在 m**j 的大作中提到】

: 我周围很多博后都考虑回国了,虽然他们在美国拿着全球最高的pay,真是奇怪