这篇来自Cell的重磅综述已为你全文翻译！此文不看，终身遗憾

Wnt信号通路是胚胎及器官发育的重要信号通路之一，参与调控机体内多种细胞的增殖、分化、极化、迁移及凋亡等过程。Wnt信号通路根据是否依赖于 β-catenin的转录活化，可分为经典通路（即 Wnt／β-catenin信号通路）和非经典通路（包括Wnt／PCP通路和Wnt-Ca²⁺通路）。

2017年5月，美国斯坦福大学医学院的Roel Nusse教授和荷兰乌得勒支大学医学中心Hans Clevers教授在《Cell》期刊（IF=66.89）上发表题为“Wnt/b-Catenin Signaling, Disease, and Emerging Therapeutic Modalities”的综述性文章，详细阐述了Wnt／β-catenin信号通路的特点。译者将全文编译如下，供相关研究领域的同学参考。

图. Wnt通路。图片源自于Xu Chen, Hongling Liu, Dehong Li, et,al. Dual Role of Wnt5a in the Progression of Inflammatory Diseases. [J] Chin Med Sci J. 2022; 37(3): 255-264. doi:10.24920/003994.

1982年，Nusse和Varmus首次发现 Wnt 家族的第一个成员以来，对 Wnt 信号的热情稳步上升。在从癌症、生物发育到早期动物进化的各个领域，Wnt 信号通路已成为一种重要的生物生长控制途径。随着相关研究的进展，有关 Wnt 信号传导的具体机制已被揭示，包括主要参与分子的结构特点。在本篇综述中，作者提供了在正常生理情况及疾病条件下，对Wnt 信号通路研究的最新进展。

在任何动物的基因组中，具有多个 Wnt 基因。例如在哺乳动物中，目前已发现19 个Wnt分子。据此，一些学者提出疑问：首先，个体 Wnt 是否具有独特或重叠功能。其次， Wnt 的独特作用是否来自功能丧失的遗传数据。最后，大多数 Wnt 基因在从基因组中消除时，生物会表现出不同的表型。例如，在Wnt1 突变小鼠中，具有较高比例的中脑缺陷。而在Wnt4 突变小鼠中，常见肾脏发育中的损害。此外，还有许多其他的表型特点与 Wnt 基因的丢失有关。

除了这些遗传论点之外，单个 Wnt 信号之间也具有差异，一个重要的证据是Wnt 蛋白的高度进化保守性。Wnt 家族中的直系同源物可见于所有动物中：在哺乳动物中，Wnt1 是 Hydra 中 Wnt1 和果蝇中Wnt1 的直系同源物。值得注意的是，在Hydra 和其他刺胞动物中，具有一组与脊椎动物的Wnt对应物。如此高度的保守性表明，不同 Wnt 的内在特性对其功能很重要。

另一方面，当涉及到信号传导机制或对靶细胞的影响时，不同的 Wnts 作用机制具有相似性。关于 Wnts 与受体 Frizzleds (FZDs) 的结合，存在广泛的交叉反应性。此外，大多数 Wnt 蛋白会导致细胞中 β-catenin 水平升高。然而，这些研究均在体外细胞中进行，可能无法揭示不同 Wnt 信号活性或受体结合的具体机制，Wnts 有多种共同受体可以调节信号传导。

综合上述研究结果，功能丧失 Wnt 表型之间的差异，可归因于 Wnt离散和独特的表达模式。由于 Wnt 蛋白在非常接近它们产生的位置发出信号，由 Wnt 基因功能丧失引起的表型改变，取决于Wnt 的局部表达情况。此外，Wnts 之间的内在差异、它们与受体、共同受体的结合，对生物的各种发育过程也有影响。

Wnt 蛋白充当细胞间信号，但关于 Wnt 细胞外形式和输出机制，还有几个未解决的问题。在合成过程中，大小为 40 kDa 且富含半胱氨酸的 Wnt 蛋白，通过附着脂质（主要为棕榈油酸酰基）进行修饰。这种修饰在所有 Wnts 之间共享，由特殊的棕榈酰转移酶引起的：Porcupine。脂质主要作为FZD 的结合基序，发挥作用，但它也使 Wnt 蛋白具有疏水性，导致Wnt蛋白束缚在细胞膜上。因此，脂质可限制 Wnt 扩散及其作用范围。

在 Wnt 蛋白成熟过程中，跨膜蛋白 Wntless/Evi (Wls) 通过脂化形式与Wnt蛋白结合，将 Wnts 运送到质膜，从而促进Wnt蛋白的分泌 (图1 )。细胞外 Wnt 信号如何转移到靶细胞，目前仍然是不是很清楚，但现有证据表明，Wnt蛋白不以游离形式存在的。有学者推测，Wnt 蛋白被整合到分泌囊泡或外泌体中，从而发挥作用。这些囊泡含有 Wls 以及成熟的 Wnt蛋白(图 1 )。Wnt 蛋白以这样的形式存在于囊泡的外部，可与受体结合。Wnt 蛋白转移，涉及由受体 FZD 及跨膜 E3 连接酶 Rnf43/Znrf3 介导的细胞之间的直接接触（图 1）。

图1.内质网中Wnt分泌模型。Porcupine通过脂质结合，对Wnts进行修饰。脂质修饰过的Wnt蛋白，其运输受Wnness/Evi（Wls）的调控，这可能涉及核内体。Wnts分泌于胞外囊泡上，在细胞外，Notum酶作为一种脱酰化酶，去除脂质，灭活Wnt。Wnt在靶细胞表明，与FZD和Wnt受体结合，细胞结合的Wnt通过细胞分裂，在组织中扩散。

一些学者曾经猜测，Wnt 信号可影响远处组织细胞，但几乎没有证据表明这是主要模式。在大多数组织中，Wnt 信号传导发生在彼此接触的相邻细胞之间。但是，在果蝇的Wnt配体Wingless中，可见Wnt的远程信号传导。最近的证据表明， WNT基因很大程度上受到膜器官束缚，形成不能扩散的蛋白质。虽然这个结果认定，Wingless 不能远程作用，但是 Wingless 与膜囊泡或丝状伪足结合，可支持Wingless在更长的距离上运行。已有研究证实，含有 Wingless 及其转运蛋白 Wntless/Evi 的囊泡，存在于果蝇的神经肌肉接头处，并与 FZD 受体相互作用。同时，一些研究也发现了 Wnt 远距离活动的其他形式，包括 Wnt 靶细胞与其相邻细胞之间的信号传导。

在另一种情况下，肠隐窝的干细胞中，与 FZD 受体表达细胞结合的 Wnt 蛋白，会随着细胞移动和分裂而被稀释。同样的Wnt 转运方式，也可见于肠道类器官培养物中（图 1）。然而，这些结果没有解决关于 Wnt 信号传导、远距离运动之间存在的争论。

在细胞表面，Wnt 蛋白与 FZD (FZD) 和 LRP5/6 两个分子的受体复合物结合（图 2）。FZD 蛋白具有 7 个跨膜 (7TM) 和一个胞外 N 端富含半胱氨酸结构域 (CRD)。CRD 是 Wnt 结合的主要相互作用模块， CRD分子存在多个相互作用的位点，包括 CRD 中与 Wnt 上的脂质结合的疏水袋。此外，Wnt 的 C 端也可与 CRD 结合。

图2. Wnt受体。FZD蛋白作为Wnt信号的主要受体。FZD分子具有7-跨膜结构域（7TM）和一个细胞外n端富含半胱氨酸的结构域（CRD）。Wnts可以结合FZD的CRD。共受体lrp是一种长链单通道跨膜蛋白，可被GSK3和CK1等多种蛋白激酶磷酸化。Wnt激动剂r-应答蛋白在细胞表面与LGR5家族成员相互作用，以增强Wnt信号传导。ZNRF3和RNF43是下调Wnt信号通路的跨膜分子。它们可调节FZD分子的E3泛素连接酶活性，导致这些受体的翻转。R-Spondin与ZNRF3的结合被认为可以下调ZNRF3的活性，从而增强Wnt信号通路。

在信号转导过程中，FZDs 与LRP5/6 结合，从而导致LRP5/6二聚化（图 2），这种机制将导致LRP5/6的构象变化。LRP 的细胞质尾部在被蛋白激酶磷酸化后，会募集支架蛋白 Axin。LRP 上的这些磷酸化，是由 GSK3 在 PPPSP 基序中的丝氨酸介导的。许多研究发现，在β-catenin、Axin 和 APC中，也存在相同的基序。

虽然 LRP 在信号传导方面具有较好的功能，但目前对于 FZD 在 Wnt信号接收中的作用，仍然不是很清楚。FZD 的细胞质部分可以与 Disheveled (DVL)结合 (图 4 ) ，然后通过 DVL 和 Axin 上的 DIX 结构域，激活 LRP 尾部和 Axin 之间的交互作用。受体结合的 DVL 和 Axin 分子形成多聚体，这种多聚体可能支持 LRP-FZD 二聚体的形成。目前，在细胞中，已经检测到含有Wnt、受体和 DVL 以及多聚化 DVL 分子小颗粒的复合物。

Wnt 不是 FZD的唯一配体，由NDP基因编码的半胱氨酸结蛋白 Norrin也可以结合并激活 Wnt 受体（图 3）。在人类中，NDP突变会导致诺里病，这是一种 X 连锁疾病，其特征是视网膜血供不足，伴随视觉功能严重丧失。Norrin可以特异性结合 FZD-4，Norrin、FZD-4 和 LRP5 的共同表达，可以有效激活 Wnt/β-catenin信号通路。一项对具有Tspan12 突变小鼠的研究，证明Tspan12 可以促进FZD4与Norrin 特异性结合（图 3）

图3. Wnt受体。(A)在调节血脑屏障或其他血管系统时，Wnt7不仅可以与FZD4和LRP相互作用，还可以与Gpr124相互作用。在血管发育过程中，Norrin可作为FZD4/LRP5复合物的配体，促进FZD4和LRP5的结合，酯蛋白Tspan12是norrin特异性的共受体。(B)RYK蛋白是跨膜酪氨酸激酶，具有类似于WIF蛋白的Wnt结合域。ROR跨膜酪氨酸激酶也可以通过类似的作用，通过FZD的CRD基序，与Wnt蛋白相结合。

FZD 还可以作为艰难梭菌毒素 B (TcdB)的受体, TcdB一种已知艰难梭菌的重要毒素。TcdB 可以与 FZD 的 CRD 结合，对几个 FZD 家族成员，具有不同的亲和力。由于 TcdB可以与 Wnt 竞争结合 FZD ，并阻断 Wnt 信号传导。因此，艰难梭菌可以阻碍肠细胞 Wnt 信号的传导，从而引发疾病。这一假设为艰难梭菌感染的治疗干预提供了理论依据。

除了核心受体 FZD 和 LRP5/6 之外，还有其他与 Wnt 信号传导有关的跨膜分子。这些分子包括 ROR 和 RYK 酪氨酸激酶受体，能够分别通过 CRD 或 WIF 结构域，与 Wnt 配体结合（图3）。一旦Wnt通路被激活，这些受体就会进入细胞中的其他信号通路。这些受体分子可以与 DVL 相互作用，导致DVL的磷酸化。

另一个受体 GPR 124，通过Wnt通路，促进血脑屏障的正常发育。Wnt7是局部作用的配体，通过FZD和LRP发挥作用，但Wnt7A是否能够直接与GPR124结合，目前尚不清楚（图3）。所有Wnt 受体，包括 ROR、RYK 和 GPR124，是否在细胞上协同作用、形成更高级的结构，或独立运作，是开发新检测方法时所需要面对的主要问题。在 Wnt-FZD复合物中，FZD与Wnt 相结合上的两个独立结合域之间，具有广泛的接触面。这表明其他分子，包括其他受体，可以参与复合物，从而产生信号转导。

正如在信号通路中常见的那样，Wnt的活性，由拮抗配体的细胞外蛋白调节。经典的例子是 Notum，这是一种羧酸酯酶，在果蝇中被发现，可以去除 Wnt 上的棕榈油酸修饰（图1），这种棕榈油酸酯对于信号传导至关重要，并参与 Wnt 与 FZD 的结合。Notum 的结构显示，该蛋白质结构中存在疏水口袋，可以容纳棕榈油酸酯。棕榈油酸酯通过Notum 作用水解后，可以在细胞膜外，留下完整的 Wnt 蛋白，在那里，Wnt可以作为主要的干扰分子。目前，关于细胞膜外的Wnt直接机制，尚不是很清楚。

常见的Wnt 拮抗剂，包括 Dickkopf (DKK) 和 Sclerostin/SOST 家族的蛋白质。这些分子通过结合 LRP5/6，拮抗 Wnt 信号，具体的直接机制，可能破坏 Wnt 诱导的 FZD-LRP6 二聚化。除此之外，Wnt 干扰分子还包括分泌的 FZD 相关蛋白 (sFRP) 和 Wnt 抑制蛋白 (WIF) 蛋白，它们都能够直接与 Wnt 结合。总而言之，Wnt 修饰因子和 Wnt 结合因子具有复杂的作用机制，这些机制可以调节Wnt信号通路的传递强度。

两个高度同源的 Wnt 靶基因，Rnf43 和 Znrf3，最近被确定为 Wnt 信号的有效负反馈调节因子。最初，有学者在Lgr5 干细胞和Wnt 通路突变的结肠癌细胞中发现，这两种蛋白质具有Wnt 依赖性。与该家族的成员 Grail 一样，这两种蛋白质是跨膜 E3 连接酶，携带细胞内 RING 结构域。Rnf43 和 Znrf3 特异性结合 FZD 的 7TM 结构域，从而导致赖氨酸残基的泛素化（图 2），这会诱导 Wnt 受体的内吞作用及溶酶体的破坏。在直系同源线虫中，PLR-1 E3 连接酶 A 可以消除 FZD 在细胞膜表面的表达。目前，E3 连接酶如何将 FZD 识别为其特定底物的具体机制，尚不完全清楚，有学者认为，DVL 蛋白在这种识别过程中充当中介。

有学者猜测，这两种 E3 连接酶的缺失，会导致信号分子对内源性 Wnt 信号的高反应性。有研究发现，在小鼠肠上皮中，这两种 Wnt 调节剂的共同缺失，会导致隐窝的腺瘤增生，在用Porcupine酶的小分子抑制剂治疗后，可以抑制腺瘤的增生。目前，已在多种人类癌症中，可以观察到 Rnf43 和 Znrf3 的突变，这使得恶性肿瘤细胞对 Wnt通路及相应受体-配体的敏感性降低。

在脊椎动物基因组中，含有四种分泌的 R-spondin 蛋白，每一种都携带两个 N -端蛋白结构域和一个血小板反应蛋白结构域。首先，一些学者发现，R-spondins是爪蟾胚胎中的 Wnt 信号增强子。随后的研究发现， R-spondin-1 在体内外可以有效促进 Wnt 依赖性的肠隐窝增殖。7-TM 受体小家族有三个成员 ，Lgr4、Lgr5 和 Lgr6 家族，可以结合 R-spondins，这对于Wnt 的信号放大至关重要。

Lgr 蛋白通过其 N 端胞外域，与 R-spondins 结合，这一过程似乎不通过 G 蛋白作用。在成体干细胞，特别是肠道细胞中，Lgr 蛋白家族，尤其是Lgr5表达丰富。Lgr4 和 Lgr5 之间，存在强烈的遗传相互作用，以维持双突变小鼠隐窝中的 Wnt 信号强度。最近的研究表明，Wnts 本身不足以促进 Lgr5⁺干细胞的自我更新，而是通过维持 Rspo 受体表达和由此产生的干细胞扩增，来实现干细胞的自我更新。

在皮肤的干细胞中，可见Lgr6的表达。因此，Lgr 蛋白作为 R-spondins 受体，加强了 Wnt 信号传导和成体干细胞之间的联系。

但是，R-spondins 和 Lgrs 是如何放大 Wnt 信号，是值得研究的问题。一系列研究证实，R-spondins 通过 Lgr ，逆转了 Rnf43/Znrf3 介导的 Wnt 受体清除。通过 X 射线晶体学模型，研究者观察到 R-spondin 与 Znrf3 的特异性相互作用。R-spondin 通过 Furin-2与 Lgr5 高亲和力相互作用，促进了其与 Rnf43/Znrf3 的相互作用。这反过来会导致 E3 连接酶的清除和活化的 Wnt/FZD/LRP 受体复合物的持续存在，从而提高 Wnt 信号强度和持续时间（图 2）。

以前的研究认为， Rnf43/Znrf3 同源物存在于无脊椎动物中，但目前的一些研究发现， R-spondin/Lgr5/Rnf43 模块也可以存在于脊椎动物中，多见于成体干细胞中。这种Wnt 信号放大机制，可能促进了脊椎动物中干细胞的进化，这与脊椎动物体型的普遍增加相吻合。

在经典 Wnt 途径中，关键开关是细胞质蛋白 β-catenin（图 4），其稳定性由破坏复合物 (DC) 控制。在该复合物中，肿瘤抑制蛋白 Axin 充当支架，与 β-catenin、APC 和两种组成型活性丝氨酸-苏氨酸激酶（CK1α/δ 和 GSK3α/β）相互作用。APC 蛋白包含三个 Axin 结合基序，这些基序散布在一系列结合 β-catenin的氨基酸重复序列之间。APC 对 DC 功能至关重要，但是目前，其特定的分子活性仍然不是很清楚（图 4）。

图4. 细胞中的Wnt信号。在没有Wnt信号的情况下，b-catenin被Axin、APC、丝氨酸/苏氨酸激酶GSK-3和CK1、蛋白磷酸酶2A（PP2A）和E3-泛素连接酶b-TrCP等蛋白复合物降解。该复合物通过磷酸化氨基端附近保守的Ser/Thrrich序列，结合b-catenin上指定的b-TrCP识别位点。磷酸化需要通过Axin搭建GSK-3和CK1和b-catenin。在磷酸化和泛素化后，b-catenin被蛋白酶体降解。Dvl也是激活该途径所必需的。在细胞核中，T细胞因子（TCF）由于与抑制因子Groucho结合而处于非活性状态。Wnt与其受体的结合，诱导了Axin与磷酸化脂蛋白受体相关蛋白（LRP）的关联。破坏复合物分解，b-catenin结构变稳定，随后与细胞核中的TCF结合，上调靶基因。APC的突变会破坏降解复合物，从而导致该通路的激活。

当 Fz/LRP 受体不与配体结合时，CK1 和 GSK3的 N 端 Ser/Thr磷酸化，促进 Axin 与 β-catenin的结合。首先。β-catenin在 Ser45 处被 CK1 磷酸化，随后， GSK3 的Thr41、Ser37 和 Ser33 残基发生磷酸化。磷酸化的基序，作为E3 泛素连接酶 β-TrCP 的对接位点，诱导泛素化和β-catenin蛋白酶体的降解。（图 4）。受体参与上述反应，促进DC 重新定位到细胞膜，并干扰其活性，从而使游离 β-catenin水平迅速增加。同时，磷酸化的 LRP 受体直接抑制 GSK-3活性，从而促进 β-catenin的稳定。关于内源性 DC 的研究表明，在完整复合物中，磷酸化 β-catenin的泛素化被阻断，随后，复合物被磷酸化形式的β-catenin饱和，导致新合成的β-catenin积累，促进β-catenin自由易位到细胞核，并激活靶基因。作为一种替代机制，有学者提出 ，Wnt 受体通过与Axin蛋白分离，参与β-catenin磷酸化的动态调节。几项研究证实， APC 中具有高度保守的调节结构域，即 β-catenin抑制结构域 (CID)，该结构域位于第二个和第三个氨基酸重复序列之间。传统研究认为，CID是下调 β-连catenin水平和 Wnt 转录活性所必需的因子。一些研究发现，CID位于突变簇区域，即癌症中 APC 的常见截断位点。有学者认为， CID 通过稳定与 APC 的结合以及抑制细胞核中的 β-catenin/TCF 转录，来促进 β-catenin 泛素化。最近的一项研究发现，GSK3 介导的 CID 区域周围的磷酸化，可以诱导 APC 蛋白的构象变化，从而使 E3-连接酶与磷酸-β-catenin的结合（图 4）。

β-catenin在上皮细胞中具有重要作用，它是各种钙粘蛋白的细胞质尾部的重要结合蛋白，例如粘附连接中的 E-钙粘蛋白。虽然 β-catenin信号池的半衰期较短，只有短短几分钟，但β-catenin与这些粘连蛋白的结合是高度稳定的。β-catenin的粘附性和信号传导特性具有独立性。研究显示，在秀丽隐杆线虫中，β-catenin的两个功能是由不同的同源物参与执行。

经典Wnt 信号通过激活 β-catenin/TCF ，从而促进靶基因转录（图 4）。在 Wnt 通路激活后，β-catenin在细胞质和细胞核中积累，在那里，它与 DNA 结合的 TCF 转录因子结合。同源的 TCF 结合基序是 5'-AGATCAAAGG-3'，广泛使用的 Wnt/TCF 报告基因，例如 pTOPflash包含该基序的多聚体。在 Wnt “关闭”状态下，TCF与 Groucho 蛋白相互作用，介导转录抑制。在 Wnt “开启”状态下，β-catenin的结合，将 TCF 瞬时转化为转录激活因子（图 4）。虽然大多数 Wnt 靶基因具有细胞类型和发育阶段特异性，但Axin2基因代表一种通用转录靶基因，通常作为经典 Wnt 通路活性的指标。

活跃的 Wnt 信号传导，涉及整体 β-catenin水平的增加。有学者提出，倍数变化不是绝对的 β-catenin 水平，这意味着，低水平的核 β-catenin 足以激活靶基因。一些研究发现，多种非 TCF 转录因子可作为替代转录效应物。与这些研究相比，在哺乳动物和果蝇细胞中，应用全基因组方法，显示直接激活 β-catenin 靶基因，均是TCF 的最终效应器。β-catenin一旦被招募到启动子和增强子元件上，就会通过其 C 端转录激活结构域，激活基因转录。除此之外，β-catenin还可以结合染色质修饰剂，例如 CBP 和 Brg-1和 Parafibromin/Hyrax，酵母 Cdc73。

Wnt 在发育过程中，对靶细胞发挥多种作用。其中，Wnt 领域最热门的焦点，在于它在健康干细胞和癌症中的作用。干细胞，无论是胚胎干细胞 (ES) 细胞还是成体干细胞，都表现出自我更新的能力，同时还能产生特化细胞。干细胞的命运和行为主要由外在的信号通路决定，这些信号通常来自干细胞生态位。

作为 Wnt 参与成体干细胞生长进化的证据，一项研究显示，小鼠 TCF4 的基因破坏，可以导致肠干细胞丢失和随后的上皮细胞破裂。许多研究发现，大多数干细胞都需要 Wnt信号通路。ES 表型可以通过两个小分子维持，一个是 Wnt， 另一个是GSK3 抑制剂 CHIR。一项研究显示，纯化的 Wnt 蛋白可以维持 ES 细胞的多能性。

在毛囊中，Wnt 信号传导在干细胞和祖细胞的生物学功能中发挥多种作用。通过 Dkk 的过表达，阻断 Wnt 信号传导，从而抑制毛囊和其他皮肤附属物的产生。在造血系统中，过表达 Axin1，可以降低可移植干细胞的数量。用分离的 Wnt3a 蛋白处理造血干细胞，会增加干细胞的自我更新。

LGR5 和 Axin2是两种强大的遗传工具，用于对已知和新型成体干细胞进行谱系追踪。Lgr5 在小肠隐窝底部的小循环细胞中表达，被认为是肠道干细胞的标志物。通过谱系追踪证明，在Lgr5 基因座特异性 CreERT2 小鼠中，不断循环的 Lgr5⁺干细胞可以形成长寿的多能成体干细胞。使用相同的谱系追踪策略，Lgr5 随后被证明可以标记许多其他器官和组织中的干细胞，包括毛囊，胃, 胰腺， 肝，肾，卵巢上皮， 内耳， 味蕾和乳腺。基于 Axin2-CreERT2 和其他基因的谱系追踪方法，揭示了乳腺中 Wnt 反应性成体干细胞的能。

类器官定义为由干细胞生长而成的 3D 结构，由器官特异性细胞类型组成，这些细胞类型通过细胞分选和空间受限的谱系定型。纯化的 Wnt 蛋白，可以增加来自乳腺成体干细胞的克隆形成细胞的数量，同时在移植后保留细胞的发育潜力。当对生长因子混合物进行精制时，观察到了更完整的类器官。基于 Wnt 依赖性 Lgr5 隐窝干细胞，在体内分裂 1000 次的观察结果，建立培养系统，允许从单个 Lgr5 干细胞生长上皮类器官（“小肠”）。干细胞悬浮在 Matrigel 中，用 R-spondin1 刺激，并辅以 EGF 和 BMP 抑制剂 Noggin。类器官生长为简单、高度极化和完全分化的上皮细胞，紧密封闭中央腔，隐窝状结构从中央向外突出生长，肠上皮的所有细胞类型均以正常比例存在。这些类器官可以生长多年，并且在遗传和表型上都非常稳定。作为这种稳定性的证明，从单个鼠 Lgr5 结肠干细胞生长的类器官，可以被成功移植到多只患有结肠炎的小鼠上。整合的类器官作为功能性上皮长期存在，与周围的宿主上皮细胞难以区分。添加 Alk 和 p38 的小分子抑制剂，以及含有间充质元素的类似培养物可以诱导多能干细胞（iPSCs）的分化。

此后，该培养系统已适应于从小鼠和人体外胚层、中胚层和内胚层组织的上皮隔室中，可以成功培养出依赖 Wnt 的成体干细胞的类器官。这一过程需要 Wnt 的有效刺激、酪氨酸激酶受体信号传导（如 EGF）的有效激活剂、BMP/TGF-β 信号的抑制和基质胶。已经报道了用于小鼠和人胃的类器官方案， 包括肝, 胰腺, 前列腺， 味蕾， 内耳，食道, 输卵管上皮, 乳腺和唾液腺。

开发有效的“替代”Wnt 蛋白，极大地促进了类器官培养中 Wnt 受体的激活，因为替代物没有经过脂质修饰，因此不需要血清衍生的载体蛋白。另一项技术的改进，涉及用合成水凝胶代替 Matrigel。目前，大多数哺乳动物上皮细胞利用 Wnt 依赖性 Axin2/Lgr5⁺干细胞，进行稳态自我更新和损伤修复，这允许建立长期培养条件下的类器官生长。

最近，在胰腺癌中，首次发现了失活的 E3 连接酶基因 Rnf43。随后，在肾上腺皮质癌中，发现了Znrf3的失活突变，这两个基因是Wnt 通路肿瘤抑制因子。在APC 野生型 (WT) 结肠癌中，可以观察到R-spondin2 或 R-spondin3 的基因融合，这些突变和融合使癌细胞对低水平的 Wnt 高度敏感，但敏感性最终依赖于外源 Wnt的水平。总之， Wnt 信号强度、干细胞特征和结肠癌干细胞行为之间联系，加强了 Wnt 驱动的干细胞与癌发生之间的联系。

有许多退行性遗传疾病，是由 Wnt 信号成分的突变引起的。表 1列出了各种疾病和突变的 Wnt 通路相关基因。在这其中，包括多个不同 Wnt 信号成分与同一疾病有关的遗传病例，包括骨密度异常、牙齿发育和视网膜异常。其中，最著名的疾病是 SOST 和 LRP6 基因突变导致硬化性骨质增生和遗传性骨质疏松症。另一个涉及多种 Wnt 成分突变的例子来自视网膜，其中家族性渗出性玻璃体视网膜病变等疾病可能由 LRP5、FZD4 或 Norrin 的突变引起（表 1）。

表1. Wnt通路与退行性疾病

这些突变的性质，不仅阐明了Wnt通路与人类健康的相关性，还揭示了相关的信号传导机制。例如，在具有遗传性异常高骨量的患者中，可观察到 LRP5 位于细胞外的结构域携带特定突变，从而产生对拮抗剂 SOST 和 DKK1 的结合不敏感的受体。在这种情况下，突变位点表明了蛋白质相互作用的位置。遗传学解读 Wnt 通路的典型案例是Robinow 综合征，这种遗传性疾病除了影响身体的其他部位外，还影响骨骼，这与三种不同的 Wnt 信号成分的突变有关：Wnt5a、ROR2和 DVL1 (表 1 )。

根据 Wnt 信号机制设计治疗方法，目前成为众多研究者考虑的问题。在考虑广泛使用的途径（如 Wnt）作为干预目标时，人们担心药物的预期副作用。然而，在 Wnt 信号传导的情况下， SOST 为骨骼疾病（包括骨质疏松症）提供了独特的治疗靶点。SOST 是 Wnt 的负调节因子之一，仅在骨骼中表达，表型仅限于骨骼组织。这表明阻断 SOST 只会影响骨骼，而不会影响其它器官。

目前，研究者已经开发出了众多小分子，阻断 Wnt 信号传导，并由敏感和定量的 Wnt 报告基因促进（表 2）。在癌症中，最有效的靶向是作用域 TCF /β-catenin复合物，因为它在通路的下游节点介导信号传导。尽管付出了很多努力，但这个靶向复合物仍然是难以捉摸的。另一种策略是筛选影响 Axin 稳定性的化合物，如 IWR和 XAV939抑制tankyrase，从而增加Axin水平并降低β-catenin以抑制Wnt信号传导。在其他水平的 Wnt 信号传导中，已发现特异性抑制剂可阻断 Porcupine，该酶催化 Wnt 蛋白的酰化（表 2）。这些抑制剂包括 IWP2、C59 和 LGK974，它们都抑制Porcupine，从而导致 Wnt 分泌受阻。在由 β-catenin/APC 突变引起的癌症中，干扰 Wnt 不太可能对肿瘤的生长产生显著影响。另一方面，有大量证据表明 ，Wnts 本身促进了转移性病变和癌症干细胞的生长。这一切表明，Porcupine靶向药物可能对肿瘤的治疗有益。在一些临床前实验中，这些药物已被证明可以抑制小鼠模型中移植肿瘤的生长。并且正在进行针对多种癌症患者，应用Porcupine抑制剂 LGK974 的临床试验。

表2. Wnt通路小分子抑制剂

癌细胞增殖中可能需要 Wnt 配体也增加了在受体水平进行干预的希望，并且在该领域存在有希望的线索。最近的一个例子来自对 RNF43 突变的胰腺肿瘤细胞敏感的突变基因筛选（RNF43 突变使这些细胞依赖于 Wnt 配体）。在 FZD5 中有几个抑制 RNF43 生长表型的突变，表明肿瘤细胞依赖于 Wnt-FZD 信号传导。作为后续研究，这些肿瘤的生长被FZD 特异性抗体抑制。类似地，在异种移植研究中，与FZD 家族成员结合的单克隆抗体 (OMP-18R5) 会抑制肿瘤的生长，而针对 R-spondins 产生的抗体会导致结肠肿瘤细胞的分化和干细胞功能的丧失。

Wnt 蛋白本身作为药物，是有问题的，因为它具有疏水性，同时合成制备过程较为复杂。然而最近，可溶性 Wnt 蛋白激动剂已被证明可在体内激活 Wnt 信号传导。此外，几种小分子化合物（L807mts、Bio、CHIR 和 SB-216763）可以干扰 GSK3，从而诱导 Wnt 靶基因表达，这些药物有望用于治疗神经退行性疾病。从机制上讲，GSK3 抑制剂在中枢神经系统中的作用，可能是由 Wnt 靶基因 REST 介导的，该基因在胚胎发育过程中充当神经元基因的阻遏物，并已被证明对阿尔茨海默病具有保护作用。

总之，在正处于 Wnt 信号传导历史的一个阶段，该通路对理解疾病的意义具有重要意义。寻找干扰 Wnt 信号的研究方法，仍处于早期阶段，但是，Wnt通路抑制剂仍然有希望成为治疗疾病的有效药物。

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