基于CRISPR的基因编辑技术在过去10年里取得了一个又一个突破。它不仅成为实验室中精准敲除基因的有力工具，基于基因编辑的疗法也已经迈进临床开发阶段，并在2023年有望产生首款获批疗法。日前，CRISPR技术先驱，诺贝尔化学奖得主Jennifer A. Doudna教授团队在《科学》杂志上发表综述文章，在总结过去10年进展的同时，展望了未来10年CRISPR技术进一步发展需要克服的挑战，以及这一领域的未来发展方向。

在过去10年里基因编辑技术突飞猛进。基于CRISPR的基因敲除技术在基础科学和转化科学方面取得了惊人的成功。如今使用CRISPR技术生成基因敲除小鼠已经成为实验室里的常规技术，而基于CRISPR基因敲除的筛选技术，让科学家们可以对人类基因组中的每个基因进行敲除。在敲除基因之外，CRISPR激活和CRISPR干扰筛选也成为调节基因表达的有力手段。

基于CRISPR的碱基编辑系统，为编辑单个碱基提供了新的工具。它们让研究人员可以通过纠正基因突变来治疗人类遗传病，而且碱基编辑可以在不分裂的细胞中改变基因组。基于碱基编辑系统的在研疗法在去年已经展开临床试验，用于治疗家族性高胆固醇血症患者。

▲基因编辑技术平台在过去10年中的进展（图片来源：参考资料[1]）

作者表示，过去10年的科学研究聚焦于构建CRISPR技术平台，而未来的10年将聚焦于如何利用这些平台对真实世界产生影响。这个过程又会面对哪些挑战？

基因编辑特异性和精确度

基因编辑在下一个10年需要解决的重大挑战包括基因编辑的特异性（只在靶点进行基因编辑）和编辑的精确度（在靶点产生预先确定的编辑结果）。为了减少脱靶编辑，科学家们已经开发出一系列具有高保真度的Cas变体。这些努力已经初见成效。CRISPR Therapeutics和Vertex，以及Intellia公司开发的指导RNA（gRNA）在临床开发过程中均未导致可检测到的脱靶编辑。此外，利用创新手段将Cas编辑器递送到靶点组织以及进一步优化已有编辑器可进一步降低脱靶效应。

编辑精确度相对来说是更大的挑战，因为传统的CRISPR基因编辑过程在生成DNA双链断裂（DSB）后，不能完全控制编辑后果，细胞固有的修复机制可能导致得失位（indel）的插入。提高编辑的精确度需要对DNA修复过程更好的理解。比如，一种策略是提高修复精度高的同源定向修复（HDR）效率，同时抑制容易出错的非同源末端连接（NHEJ）修复方式。不过即便如此，DSB还可能导致大型片段丢失和染色体重组等风险，会导致基因组稳定性下降。

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碱基编辑和先导编辑（prime editing）代表着避免DSB产生的精准编辑策略。与传统Cas9介导的基因编辑相比，碱基编辑和先导编辑降低了indel的产生几率。不过对于碱基编辑器来说，编辑精度受到旁观者编辑的影响，这指的是如果编辑器的编辑窗口（可编辑的碱基数目）超过一个碱基，就可能对与靶点碱基周围的碱基进行修改。此前的一项研究对21种不同的碱基编辑系统进行了检测，发现接近一半的系统会在编辑窗口产生旁观者编辑。

目前，科学家们正在使用定向进化、计算机辅助设计等手段，降低碱基编辑器的旁观者编辑效应。碱基编辑的广泛应用需要克服在不影响编辑效率和靶点特异性的情况下，改进编辑窗口的挑战。

高效插入基因序列

新兴的CRISPR工具能够精准地在基因组中插入基因序列，未来10年的重大挑战之一是对这一技术进行优化和有效应用。传统的Cas9基因编辑可以通过依靠HDR来将转基因引入基因组的特定位点，然而这一策略的局限性在于只能在分裂细胞中使用，递送修复模板方面的困难和产生DSB带来的编辑精度问题。

先导编辑代表着一种不需要引入DSB就能插入和删除DNA序列的策略。它可以在分裂和非分裂细胞中引入DNA序列改变。目前，先导编辑已经在多种细胞类型中显示出特异性和精准编辑活性。不过它的广泛应用仍然受到编辑效率低的限制。在一项研究中，先导编辑在类器官中纠正基因突变的效率比HDR低30倍。虽然更高效的先导编辑器已经被开发出来，不过这些编辑器更容易引入indel。先导编辑器在未来10年的目标是在提高编辑效率的同时，维持编辑产品的纯度。如果能够达到这一目标，先导编辑有望成为最具灵活性的精准编辑工具之一。

在插入大型基因片段方面，基于CRISPR相关转座酶（CAST）技术和基于整合酶的新一代基因编辑技术已经在体外细胞研究中成功插入长达7~10 kb的DNA序列。这些技术仍然处于早期开发阶段，需要进一步优化来提高编辑效率，才能成为潜在治疗策略。

▲基因编辑需要解决的挑战（图片来源：参考资料[1]）

编辑器的体外和体内递送

将基因编辑系统递送到动物体内仍然是基因组编辑的主要瓶颈。目前递送基因编辑系统的策略主要有两种，体外递送策略通常用于编辑造血干细胞和祖细胞，以及白细胞。这一策略提供更高的细胞类型编辑特异性，以及对编辑结果更严格的控制。不过，它只能用于从体内分离后能够存活、增殖、并且维持原有功能的细胞类型。

体内递送可以大幅度扩展基因编辑的细胞类型范围，让基因编辑可以用于治疗更广泛的遗传病。目前，治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）和遗传性血管性水肿的体内编辑疗法已经获得临床概念验证。

这些成功显示了体内基因组编辑的广阔前景，不过体内递送CRISPR编辑系统仍然是个艰巨的挑战。递送系统需要避免载荷降解，被血管细胞通过吞噬作用排出，有效触达靶细胞并通过内吞作用释放载荷，载荷释放后需要进入细胞核并且与靶点结合。所有这些中间步骤需要创新和工程化改进来解决。

其中一个方向是控制载体的大小，这驱使研究人员发现更小的CRISPR编辑器，让它们更容易有效递送。另一个挑战是防止编辑系统被脱靶细胞吞噬并且编辑脱靶细胞。将与特定靶点结合的靶向分子与CRISPR编辑系统偶联可以解决这一挑战。

基于病毒的载体包括腺相关病毒（AAV），腺病毒和慢病毒，其中AAV已经用于临床试验，递送治疗Leber先天性黑蒙10的基因编辑疗法。不过AAV载体的主要局限是载荷大小有限，而且基于病毒的递送技术通常在生产方面成本较高。

基于合成材料的递送系统包括脂质纳米颗粒（LNP），阳离子聚合物和多肽，以及金纳米颗粒。它们通常提供对疗法更高的控制水平和灵活性。LNP作为递送策略已经在人体临床试验中获得概念验证。不过，通常这些基于合成材料递送手段的递送效率低于基于病毒的策略，因此在体内递送时难于触达某些器官。

最近，细胞外囊泡和类病毒颗粒成为新兴的递送平台，它们有可能结合病毒和合成材料递送策略的优点，在维持高效递送的同时降低安全性隐患。

基因编辑为开发细胞和基因疗法，治疗甚至治愈疾病铺平了道路。以镰刀型细胞贫血病（SCD）为例，目前至少有8项FDA批准的临床试验，使用基于CRISPR的疗法治疗SCD。首款治疗SCD的基因编辑疗法有望在2023年获得FDA的批准。不过，基因编辑疗法的广泛使用仍然需要解决疗法的生产问题，体外编辑的细胞疗法生产过程繁琐并且成本不菲，如果新的递送模式能够避免体外基因编辑，对于扩展基因组编辑疗法的应用将起到变革性的作用。

除了临床应用之外，CRISPR基因编辑正在对农业产生重大影响，CRISPR编辑的食物已经开始上市。在育种方面，CRISPR基因编辑让将一个物种的有益特征转移到另一个物种的过程更为高效和简单。

▲基因编辑的未来应用前景（图片来源：参考资料[1]）

未来10年，基因编辑领域将在机器学习、活细胞成像、更快速的DNA测序等技术的推动下，更快地发展。作者表示，我们无疑将看到更多临床试验，为设计新一代细胞和基因疗法体提供数据。随着治疗疾病的安全性和效力得到确立，CRISPR有望成为神经退行性疾病和心血管疾病的预防性疗法。通过CRISPR改造产生的产品，不管是用于人类移植的猪器官、耐旱高产的农作物、还是利用CRISPR编辑改善人类健康的微生物组，都将变得更为常见。

来源：药明康德