仙桃学术 | 生信怎么加湿实验？手把手教你4+干湿结合零代码复现

各位小伙伴大家好我是Mira～又来跟大家分享生信文章零代码复现啦～今天我们分享的文章也是刚出炉不久，热乎的，而且充满了仙桃风！

文章题目是：《Expression characteristic, immune signature, and prognosis value of EFNA family identified by multi-omics integrative analysis in pan-cancer》，2022年发表在《BMC Cancer》上，影响因子4.43分。这是一篇干湿结合的文章，很多小伙伴还对生信文章怎么加湿实验有点疑惑，这一篇就是很好的示范～

仙桃学术https://www.xiantao.love

HPA（(Human Protein Atlas) https://www.proteinatlas.org

STRING

https://www.string-db.org/

GSCA数据库http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/）

TISIDB数据库

http://cis.hku.hk/TISIDB/index.php

Cbioportal数据库

https://www.cbioportal.org

Timer2.0数据库

http://timer.cistrome.org/

Fig1 EFNA家族的功能预测高度相关。EFNA1，EFNA2，EFNA3，EFNA4

先来看图1A，EFNA家族在泛癌中的表达相关性分析。分子相关性分析，上仙桃。

找到“分子相关性分析”的“相关性热图”，仙桃云分析里目前还没有泛癌的数据，咱们就随手选一个癌种，把分子输入进去，按照上图设置一遍，直接出图：

这里我选的结直肠癌，大家就选择自己研究的癌种就行啦～

再来看图1B，PPI网络，String数据库大家应该都非常熟悉了吧～上！

点击Search，

按照如上，填入分子后再点击Search：

得到结果。这里我已经选择最低的可信度了，但是还是只得到5个分子间相互关联，所以就算是同样的分子，同样的数据库，不同时间去分析都还是会有不同的结果，大家复现文章的时候也不必纠结于完全复现，重在掌握方法～

但是咱们文章里String数据库得到的这个图是不太能直接用的，接下来我们就来美化一下～首先下载结果文件。

只需要前两列，后面的都可以删掉。然后进入仙桃，找到“高级网络图”

上传我们整理好的文件，选好图片类型

就是这样了，跟文中的预测结果有很大出入，由于作者并没有描述PPI网络构建的具体信息，咱们也只能复现到这种程度了，还是掌握方法～

接下来图1C，作者对PPI网络中的分子进行了GO/KEGG富集分析，这里因为我没有得到其他的分子，直接用作图1B中展示的基因进行分析。继续上仙桃～

选择GO/KEGG富集分析，填入分子，确定

分析完成后保存结果

进入可视化模块，选择本次分析结果（注意不要选错啦～），选气泡图

图1完成！

来看图2

EFNA家族在泛癌中的表达

图2整个都是EFNA家族在泛癌中的表达差异，来看A图～先进入GSCALite数据库：

按照红框中选择，填好分子，选择好癌中和研究内容，这次咱们是研究这五个基因在所有肿瘤中的表达情况，开始分析

分析完成后就可以找到左边功能模块里的TCGA mRNA基因表达分析的模块，页面下拉

酱酱，泛癌表达差异图就出来啦～

咱们再来复现图2B，以EFNA1为例，还是仙桃：

选择“配对样本”，泛癌，填入分子，确认

其他四个兄弟再每个来一遍，就能得到图2B啦

之后的蛋白表达结果是HPA数据库中得到的

以EFNA1为例：

选择Pathology

结果页面下拉就能找到EFNA1蛋白在不同癌症中的表达情况～

图3 泛癌中EFNA家族的变异和DNA甲基化。

来看图3A，直接进入cbioportal，

选择泛癌，按基因查找

我们要分析的是突变数据，输入分子，提交

选择EFNA1为例

就得到啦～其他的分子也是一样的～

接下来是B图，先进入GSCA数据库

选择突变分析，填入分子，选择所有癌症，最后勾选需要分析的内容

就能看见结果啦，首先是CNV信息，就是右边那张图

这就是B图

然后是甲基化的图

点击可下载，这就是C图

接下来是甲基化差异，右边的小图可以直接作为结果使用，也可以下载左边的表格自己进行可视化，这就是图3D啦～

然后是图4: 泛癌中EFNA家族表达与肿瘤微环境的相关性分析。

这个图虽然仙桃暂时还不能零代码直接得到，但是这三个评分咱们可以先用仙桃算出来：

在免疫浸润模块选择散点图，以EFNA1为例，选好三个评分，确认

可以在结果的部分得到每个评分的相关系数，每一个癌症中做一遍，这个基因的三个评分在癌症中的相关性就能得到啦

最后手动整理一下，可以在仙桃的相关性热图里进行可视化，虽然麻烦一点，但是也还是不需要用到代码～

接下来是图5: EFNA家族的肿瘤浸润免疫细胞。

这个图就是用Xcell和Timer两种算法对EFNA基因家族与免疫细胞浸润进行分析。零代码的免疫分析咱们可以利用Timer2.0：

选择免疫相关的基因模块

以EFNA1为例，选好免疫细胞，提交分析：

分析完成后下载结果：

就可以得到这样的图，这里面就有基因在每个癌症以及每个细胞的多种算法集合，大家可以根据Table结果进行可视化～

然后图6

图六咱们零代码还暂时没法完成。但是这里A图用到的分型来自TISIDB数据库：

填好分子后：

以EFNA1为例：

选择subtype

就可以看到这6种免疫亚型了，文章就是根据这个结果分析的～

之后的EFNAs表达与RNAss/DNAss肿瘤干度之间的相关性分析以及雷达图显示EFNA表达式与TMB/MSI之间的相关性暂时应该还没法零代码完成，可以催催仙桃后台小哥哥～

最后图7, EFNA家族在癌症中的临床价值

图A和B是基因表达泛癌中与每个癌症OS/DFI/PFI的关系。这个咱们暂时也不能一件出图，但是有了仙桃，咱们也只是需要整理一下数据而已～

在预后分析的KM曲线图里，1⃣️EFNA1为例，三种预后指标的计算都有，我们以OS为例：

就能得到基因在癌症中的HR值

同样重复做几次，把得到的HR值整理一下，就可以到“表达差异”的热图板块可视化了～

C图之后是在肺腺癌中的分析，仙桃痕迹非常明显～

先来C图，直接上仙桃：

在ROC板块里，选择肺腺癌TCGA联合GTEx的数据，选好5个分子

图就来啦～

D图是GEO数据集的生存曲线，这个虽然不能一键出，但是大家下载好这三个数据集的临床信息，然后找到基础绘图的生存曲线部分：

如果不知道需要把数据整理成什么样，可以查看教程文档：

就这样，就能做图啦～

E图：nomogram。这里作者只用了EFNA5，结合临床数据

在预后列线图模块，选择肺腺癌，EFNA5，以及临床分期等，跟文章一样：

加上预测年限

出图～

F图，Calibration校准曲线，废话不说直接仙桃：

找到预后calibration分析

选择肺腺癌，选好分子和临床信息，预测时间

等待结果

在Calibration可视化模块：

选好刚才的分析：

直接出图～不得不说这个校准度结果非常的nice！与理想的线非常接近！

生信部分最后一张森林图！EFNA5在不同亚族中的生存分析，这个图也可以通过整理数据在仙桃零代码得到：

就以性别为例：

在亚组KM曲线中选择上图选项

就可以得到该基因在女性中的HR值等数据

照着文章的每个分组做一遍，把得到的结果整理成下面这样：

然后到基础绘图的森林图模块：

上传文件就可以啦～

虽说本篇文章生信部分有一些图不用代码还是有点工作量，得重复很多遍操作，整理数据，但是，对于没有代码基础的小伙伴，这些只需要花一些机械的时间去整理，对很多小伙伴来说不会有学代码需要的那么多时间成本。所以虽说不会代码，用好数据库和分析工具，也一样可以做出复杂又美观的图片～

接下来就是基础实验了：

作者做了哪些湿实验呢？

作者只选择了EFNA5，在细胞中验证了表达差异，做了western blot、免疫组化、RT-qPCR，并收集了临床标本进行生存分析。其实就是一些基础的分子表达差异验证，所以大家想要干湿结合也不用迷茫，干为主的文章咱们就验证一下基因表达即可～

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