在这个风起云涌的时代，点到这款单细胞测序工具就是“血赚”！！！

在这个测序技术应用和发展风起云涌的时代，DNA/RNA测序早已成为科研工作中的家常便饭。以往，RNA测序技术是基于检测样本中所有RNA转录本的方式来发现新型RNA分子或进行基因表达差异分析，获得的是组织样本或多细胞群的成千上万个细胞的综合结果，不同细胞亚群之间的差异往往被掩盖，尤其是在肿瘤异质性和免疫细胞亚群相关研究中，传统的测序技术显得捉襟见肘。正如同世界上没有完全相同的两片树叶一样，生物体中没有两个细胞是完全相同的，于是单细胞测序（single-cell sequencing）技术应运而生。

自2013年被Nature Methods评为年度技术以来，近些年异军突起的单细胞测序技术逐渐显露出当红小鲜肉的潜质，并俘获一大批芳心青睐。单细胞RNA-seq最大的优势在于，能够独立地提供每个单细胞RNA表达谱数据，揭示每个细胞独特的微妙变化，使不同细胞类型得以精细区分，甚至可以鉴定并揭示新的细胞类型，使得在单细胞水平进行分子机制研究的设想成为可能。单细胞RNA-seq流程大的方面包括三个步骤，分别简述如下。

单细胞分离

即从异质性细胞群体中分离出单细胞，方法众多。高通量技术，如荧光标记流式细胞分选（fluorescence activated cell sorting，FACS）和免疫磁珠细胞分选（MACS）技术，可根据细胞大小/形状或表面标志物进行有偏向的选择。基于微流体和液滴的技术，如Fluidigm C1、10x Genomics Chromium和Bio-Rad ddSEQ Single-Cell Isolator系统可实现细胞无偏向分离。若对通量要求不高，可选择显微镜下手动挑选细胞，或采用激光捕获显微切割系统（aser capture microdissection，LCM），都是基于细胞形态或荧光报告基因表达的有偏向选择，优点在于可以了解单细胞所处细胞环境，缺点在于需要精细操作以免切到细胞或细胞核。相比之下，细胞有限稀释获得单细胞克隆的方法就是无偏向的。

RNA抽提、建库和测序

首先，裂解分离出的单细胞并纯化获得总RNA，可通过自动化设备或市售试剂盒来完成，设备如前文Fluidigm C1、10x Genomics Chromium和Bio-Rad ddSEQ Single-Cell Isolator，试剂盒如Thermo Scientific Single Cell Lysis Kit等。然后，大多数方案是通过polyA选择来富集mRNA，并以修饰的oligo dT引物进行逆转录。逆转录过程中，有些方案利用独特分子标识符（UMI）对单分子标记，可以更精确地定量单细胞中mRNA分子初始量。之后，通过体外转录或PCR扩增cDNA构建文库，用于高通量测序。目前测序方法众多，更新换代较快，2020年4月Nature杂志一篇题为Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects的论文阐述了不同单细胞测序技术的差异，并重点比较了13种常用scRNA-seq和单核RNA-seq实验方案优缺点。

目前主流的3种测序技术分别是：

数据分析

单细胞数据往往存在批次效应，给不同数据集之间的整合分析带来困难。导致批次效应的原因非常多，包括不同单细胞转录组建库技术带来的转录本捕捉效率和序列偏好差异，不同实验批次的操作差异，不同测序批次的测序深度差异，不同物种表达调控的差异，甚至是不同生物信息学分析流程带来的差异等等。因而跨数据集分析之前做好数据整合或矫正尤为重要。目前单细胞数据分析流程已经有非常完善的框架，大体上可以分为两步：

单细胞测序的应用领域相当广泛，肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等等。它也是高分文章的常客，Cell、Nature、Science上不同研究方向的单细胞测序文章比比皆是。可以说，了解了单细胞测序就了解了生命科学领域的最前沿发现。

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